正交试验设计优化丝绸水解条件

刘 娟，杨 柳，徐方圆，施超欧，吴珊珊，郑 翠

(1.华东理工大学化学与分子工程学院，上海200237;2.上海博物馆馆藏文物保存环境国家文物局重点科研基地，上海200050)

中国是丝绸文化的起源地［1］，丝织品自古以来就备受人们的青睐，丝绸文化是中华文化不可分割的一部分［2］。丝绸品种繁多，色彩绚丽受到历代达官贵人的钟爱，在历代的陪葬品中丝织品几乎随处可见。在各地的考古工作中不断有丝绸文物出土的消息，包括近年来湖州钱山漾出土的三千多年前的丝带［3］、南京长干寺出土的宋代丝织品［4］、新疆尼雅遗址出土的汉绮［5］等。除了大量的出土丝织品外，各类博物馆还收藏了大量春秋至清代的传世品和已出土的丝织品、服饰等。由于丝绸的特殊性，这些珍贵的文物保护尤其迫切。

大量的丝织文物吸引了众多学者对丝绸进行了保护、人工老化、检测方法等方面的研究。常用的检测方法包括扫描电子显微镜［6］、色差法［7］、氨基酸检测法［8］等，其中氨基酸检测法由于其准确性成为一种可靠的丝织品成分分析方法。目前氨基酸的分析方法有柱前衍生高效液相色谱法［9-11］、柱后衍生高效阳离子交换液相色谱法［12-14］等。由于大多氨基酸本身并不能吸收紫外可见光，需要对其进行衍生，生成具有紫外可见吸收或者荧光响应的衍生物才能进行分析测定。本试验采用柱前邻苯二甲醛(OPA)与芴甲氧羰酰氯(FMOC-Cl)联用在线自动衍生(参考安捷伦公司氨基酸标准分析方法)，方法简便、可在线完成衍生操作，不需要特定氨基酸分析仪，普通液相色谱也能完成分析，使用荧光检测选择性强，基体干扰小，方法重现性好，定量准确等特点，具有很好的应用前景。

目前大多数的氨基酸分析法均采用相同的酸水解条件，即用6 mol/L盐酸，110℃恒温水解22 h［13］。这种方法在多个国家标准中作为标准的蛋白水解条件，例如 GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的测定》、GB/T 18246—2000《饲料中氨基酸的测定》及谷物籽粒氨基酸测定的前处理方法。这种水解条件适合大多数蛋白质水解，但不具备针对性。针对丝绸的特点，其氨基酸的结构不同于普通的蛋白质，丝蛋白结晶度为50%～60%，以不溶于水的β折叠结构为主，非晶区则是更为松散的结构［14］。过于剧烈的水解条件容易破坏易降解的氨基酸，而不充足的水解条件又不能使蛋白质尽可能水解为氨基酸，两者均会造成检测结果偏低。针对丝织品的特点，采用正交试验设计法进行丝织品水解条件的优化，从而得出最适合丝绸的水解条件，为准确检测分析丝绸中氨基酸含量创造条件。

1 试验

1.1 材料与仪器

材料:丝绸坯布(市售 11218电力纺，经密595根/10 cm，纬密420根/10 cm，白色)，盐酸(优级纯，阿拉丁试剂(上海)有限公司)，苯酚(分析纯，阿拉丁试剂(上海)有限公司)，超纯水(18.2 MΩ·cm，自制)，磷酸二氢钾(分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司)，磷酸氢二钠(分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司)，乙腈(色谱纯，HoneyWell公司)，甲醇(色谱纯，上海凌峰化学试剂有限公司)，邻苯二甲醛(分析纯，阿拉丁试剂(上海)有限公司)，芴甲氧羰酰氯(分析纯，阿拉丁试剂(上海)有限公司)，3-巯基丙酸(分析纯，阿拉丁试剂(上海)有限公司)，氨基酸标准溶液(安捷伦科技有限公司)，硼酸盐缓冲液(安捷伦科技有限公司)，10 mL顶空瓶(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)，顶盖钳，顶空钳，高纯氮。

仪器:Infinity1260型高效液相色谱配有DAD和FLD检测器(安捷伦科技有限公司)，Reacti-Therm干式氮吹仪(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)。

1.2 正交设计

将影响水解结果的3个重要因素按3水平4因素的正交表排布，得到水解试验的正交试验设计表。

表1 水解正交试验设计Tab.1 Orthogonal experimental design for Hydrolysis____

按表1中试验条件，以随机顺序完成以上9组试验，另外，按照6 mol/L盐酸，110℃恒温水解22 h的标准条件进行一组试验作对比。每组试验重复3次，取平均值即为试验结果。

1.3 溶液配制

水解液配制:将优级纯盐酸稀释成2、4、6 mol/L盐酸溶液，水解时按每10 mL盐酸加入5滴热苯酚的比例配制成相应浓度的水解液。

邻苯二甲醛(OPA)溶液的配制:准确称取50 mg OPA，加500μL甲醇溶解，再加入75μL的3-巯基丙酸，用硼酸缓冲液定容至5 mL，摇匀。

芴甲氧羰酰氯(FMOC-Cl)溶液的配制:准确称取 12.5 mg FMOC-Cl，用乙腈定容到 5 mL，摇匀。

1.4 丝绸样品制备

根据GB/T 5009 124—2003《食品中氨基酸的测定》中的要求，水解蛋白质时，蛋白质与水解液的比例应为2︰3～2︰1(单位为mg/mL)。本试验水解液体积应该在5～15 mL之间。考虑到丝绸中蛋白质结构较脆弱，容易水解，故水解液体积估取6 mL。称取(10.0±1.0)mg丝绸，放入10 mL洁净的顶空瓶内，加入6 mL水解液，用瓶盖钳钳紧。盖上镀聚四氟乙烯的垫片和铝盖，用压盖钳将顶空瓶钳紧。

将装好样品和水解液的顶空瓶放入干式氮吹仪加热模块中，按照正交试验设计表试验条件设定温度，并在规定时间取出样品。

将水解好的样品转移至100 mL容量瓶中，用超纯水稀释定容，进样。

1.5 色谱条件

分析柱:ZORBAX Eclipse AAA分析柱 4.6×150 mm，粒径 3.5μm。保护柱:ZORBAX Eclipse AAA保护柱4.6×12.5 mm，粒径5μm。流动相:A路为40 mmol/L、pH=7.8的磷酸缓冲盐，B 路为45︰45︰10的甲醇乙腈水混合溶液。0～1.9 min，100%A路;1.9 ～18.1 min，A 路比例降为 57%;18.1 ～18.6 min，A 路比例降到零;18.6 ～ 22.3 min，A 路比例为0;22.3 ～23.2 min，A 路比例上升到100%;23.2～26 min，A路比例为100%。

检测波长:DAD检测器，波长238 nm;荧光检测器，激发波长340 nm，发生波长450 nm。

衍生:采用OPA与FMOC-Cl联用在线自动衍生(参考安捷伦公司氨基酸标准分析方法)。

2 结果与讨论

2.1 正交结果

通过对各氨基酸结果进行直观分析和方差分析，可得到水解结果(表2)。

表2 水解试验结果Tab.2 Results of hydrolysis experiment

2.2 正交结果分析

由于酸水解后胱氨酸、甲硫氨酸降解严重，因此不对这两种氨基酸做结果讨论。方差分析中涉及的显著性水平α，指的是对作出的判断大概有1－α的把握。可在F分布临界值表中查出Fα(F温度/浓度/时间，F误差)。当 α =0.10，F 温度/浓度/时间 ＞ Fα，说明有90%以上把握认为因素对结果影响显著，以“*”表示;α =0.05，F 温度/浓度/时间 ＞ Fα，说明有 95%以上把握认为因素对结果影响显著，以“＊＊”表示;α=0.01，F 温度/浓度/时间 ＞ Fα，说明有 99%以上把握认为因素对结果影响显著，以“＊＊＊”表示。以“*”表示某因素对结果影响的显著性，下划线表示该因素是最重要的影响因素。具体结果见表3。

表3 氨基酸正交结果分析Tab.3 Analysis of orthogonal results of amino acid

由表3可知，对水解效率影响最大的因素主要是水解液浓度，其次是水解温度，这两者的影响都比较大，而水解时间也有一定的影响，不过较前两者影响要小得多。而水解液浓度有两种选择:4 mol/L和2 mol/L。水解温度则是105℃更为合适。水解时间也有两种选择:15 h和18 h。这也就意味着最优水解条件现在可能有4种组合。其中4 mol/L盐酸水解液，105℃恒温水解15 h正是试验4的条件，但2 mol/L盐酸水解液，105℃恒温水解15 h、18 h及4 mol/L盐酸水解液，105℃恒温水解18 h并未在试验表中，所以需要对这3个条件进行验证试验，以确定水解的最优条件。

2.3 验证试验结果分析

按上述总结的3个试验条件进行验证试验，发现2 mol/L盐酸，105℃恒温水解15 h、18 h后，丝绸样品并未水解完全，可以清楚地看到有部分丝绸残片悬浮在水解液中，因此2 mol/L盐酸水解液的条件不可行。以下就以4 mol/L盐酸水解液，105℃恒温水解18 h的水解条件为验证试验的条件进行分析对比。

由表4数据可知，试验4条件下，各氨基酸水解率均为最大值或者接近最大值，是最适合丝绸水解的条件。故4 mol/L盐酸水解液，105℃恒温水解15 h为最优条件。

表4 验证试验结果与正交试验表对比Tab.4 Comparison of verification test result and orthogonal test table

2.4 最优水解条件色谱图

荧光及紫外线色谱见图1、图2。

图1 试验4荧光检测色谱图Fig.1 Fluorescence detection chromatogram of fourth experiment

图2 试验4紫外线检测色谱图Fig.2 UV detection chromatogram of fourth experiment

图1中由于18 min后会有很高的衍生试剂响应信号，对比之下氨基酸峰则会小到忽略不计，故时间窗展示范围改为氨基酸出峰时间0～18 min。

2.5 最优条件与标准条件对比

表5 标准条件与最优条件结果对比Tab.5 Comparison of results under standard condition and optimal condition

用4号试验结果减去常用条件结果，再将这个差值比上标准条件结果，即为含量提高的百分比。由于含量较低的氨基酸容易受处理过程的影响，容易造成较大误差，表5中显示的是含量超过0.5 g/100 g的氨基酸变化情况。

3 结论

1)通过正交试验设计法，对水解结果影响最大的3个因素进行正交设计，由正交试验结果可知:在最优水解条件下，尽可能提高了各氨基酸的含量，能真实反映出待测丝织品中的真实氨基酸含量，特别是低含量的氨基酸。在试验4的水解条件下含量超过0.5 g/100 g的氨基酸中，除异亮氨酸外，各氨基酸含量明显高于标准条件水解后的氨基酸含量，增幅在5.88% ～73.13%，而总氨基酸的含量增幅更是达到了 13.68%。

2)与优化水解方法对比，结果表明常规标准水解条件不适合丝绸样品的水解，减少水解强度可有效降低氨基酸的降解。尤其某些活泼氨基酸，如酪氨酸、丝氨酸更容易在剧烈的水解条件下降解，而这些氨基酸往往是判断丝织品老化程度的关键。因此，优化丝绸水解条件是保证丝织品氨基酸研究结果正确的关键步骤和前提条件之一。

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