长期有氧运动对慢性心力衰竭大鼠心肌能量代谢的调节

王勇，马延超

（1.潍坊学院 体育学院，山东 潍坊 261061；2.洛阳师范学院 体育学院，河南 洛阳 471022）

心肌细胞代谢性重塑是心力衰竭(heart failure，HF)发生发展的重要机制。HF时心肌脂肪酸(fatty acid，FA)氧化减少、葡萄糖利用增加[1]，能量代谢的效率增加，这是心肌的自我保护机制。但同时糖酵解代谢增强，乳酸产生增多造成酸中毒与心肌损害，FA利用减少，脂质在心脏沉积并造成心肌细胞凋亡与脂毒性心脏异常[2]，加之HF时线粒体生物合成减少[3]，能量生成进一步下降，即所谓的心肌能量饥渴(energy starvation)[4]，心功能继之恶化，因此心肌代谢性重塑又加速了HF进程。

有氧运动可改善HF患者心肌代谢异常，但具体分子机制尚未明确。AMPK(磷酸腺苷活化蛋白激酶)是一种调节细胞内能量代谢的酶类，其主要作用是通过激活下游信号转导途径促进能量产生，维持细胞的能量平衡稳态。研究发现，AMPK在心脏的正常发育以及心肌代谢过程中起重要作用，同时对心肌缺血-再灌注损伤起保护作用[5]。关于运动与 AMPK关系的研究主要集中在骨骼肌组织，而在心肌表达的研究较少，Coven等[6]和Musi等[7]发现，一次急性运动可上调正常心肌AMPK活性或表达量，并呈现运动强度依赖性，提示AMPK在心肌能量代谢以及对运动适应中起重要作用。但长期运动对HF心脏AMPK表达及对能量代谢的影响未见报道。本研究以心梗后慢性HF大鼠为模型，观察8周有氧运动对心功能、心肌糖原、FA和乳酸含量以及 AMPKα、PPARα、CPT-1、GLUT4、PGC-1α基因表达的影响，探讨长期有氧运动对HF心脏代谢性重塑的影响及可能机制。

1 研究对象和方法

1.1 实验动物

SPF级SD大鼠45只，体质量260~320 g，雌雄各半，由北京维通利华实验动物中心提供，分笼饲养，自由进食水。

1.2 心梗后HF模型的建立

大鼠随机分为心梗组(MI组，30只)和假手术组(Sham组，15只)。心梗组采用冠状动脉结扎术方法：麻醉后连接呼吸机，开胸暴露心脏，由左心耳下方2~3 mm处用0号丝线结扎左冠状动脉前降支。Sham组只开胸穿线，不结扎，其他操作同MI组。MI组再随机分为心梗对照组(MI-Sed组)和心梗运动组(MI-Ex组)，每组各15只。Sham组和MI-Sed组保持安静状态，MI-Ex组进行为期8周的运动训练。

1.3 有氧运动方案

采用Bedford等建立的大鼠跑台运动方案：即5 min热身(坡度为0°，速度为5 m/min)后，坡度调为5°，速度为 10 m/min(相当于 45%VO2max)，第 1天训练 15 min、第2天30 min、第3天45 min，从第4天开始均为60 min。5 d/周，共训练8周。

1.4 血流动力学参数(心功能)测定

腹腔麻醉大鼠，心导管插管至左心室，连接压力换能器，利用多媒体生物信号采集处理系统记录左心室收缩期压力(LVSP)、左心室舒张末期压力(LVEDP)、左心室压力最大上升速率(＋(dp/dt)max)和左室压力最大下降速率(－(dp/dt)max)。

1.5 取材

大鼠断头处死后取心脏，用生理盐水冲洗，滤纸沾干后迅速将组织置于液氮中并转移至－80 ℃冰箱冻存待测。

1.6 心肌FA、糖原和乳酸测定

均采用比色法测定心肌匀浆液中糖原质量分数、FA浓度和乳酸质量摩尔浓度，严格按照试剂盒(南京建成生物工程研究所)操作说明进行。单位分别为：mg/g、mmol/L、μmmol/g。

1.7 实时荧光定量 PCR检测心肌 PPARα和 CPT-1 mRNA水平

将心肌匀浆后，用Trizol法抽提总RNA，逆转录反应获得cDNA，实时荧光定量PCR(ABI 7900HT型荧光定量PCR仪，美国)测定PPARα和CPT-1 mRNA含量，引物序列见表1，扩增条件：预变性95 ℃，1 min；94 ℃，30 s；54 ℃，30 s；72 ℃，1 min。共40个循环。以β-actin作为内参，计算相对表达量。

表1 引物序列及产物长度

1.8 Western blot测定心肌总AMPKα蛋白、磷酸化AMPK α蛋白(p-AMPKα)、GLUT4和PGC-1α表达水平

裂解细胞后提取细胞总蛋白，采用BCA法进行蛋白定量。灌制10%的分离胶和5%的浓缩胶，恒压120 V、80 mA预电泳10 min，上样，进行SDS-PAGE电泳，转移至PVDF膜上。5%脱脂奶粉室温封闭1 h，兔抗大鼠 AMPKα、AMPKα-Thr172磷酸化、GLUT4和 PGC-1α多克隆抗体于 4 ℃孵育过夜，TBST洗涤PVDF膜。加二抗后室温孵育1 h，暗室中滴加发光底物混合物2 mL于PVDF膜上，曝光、显影、定影。对目的蛋白进行光密度分析，以β-actin为内参。目的蛋白相对含量＝目的蛋白灰度值/β-actin蛋白灰度值。

1.9 心肌组织病理学观察

沿心脏长轴将心尖至结扎点取2 mm厚组织制作切片，40 g/L多聚甲醛固定，石蜡包埋，Masson染色，普通光镜观察各组心肌组织病理学变化。

1.10 统计学分析

所有数据使用SPSS 15.0统计软件进行数据分析。数据以“平均数±标准差”表示，使用单因素方差分析进行统计学检验，各组两两比较使用LSD检验。显著性水平定为P<0.05，非常显著水平定为P<0.01。

2 结果及分析

2.1 大鼠血流动力学参数的变化

表2结果显示，与Sham组比较，MI-Sed组LVSP、±(dp/dt)max显著性下降(均为P<0.01)，LVEDP则显著性升高(P<0.01)；与MI-Sed组比较，MI-Ex组LVSP、±(dp/dt)max显著性升高(均为P<0.01)，LVEDP则显著性下降(P<0.01)。

表2 有氧运动对大鼠血流动力学参数的影响

表2 有氧运动对大鼠血流动力学参数的影响

与MI-Sed组比较，1)P<0.05，2)P<0.01；与Sham组比较，3)P<0.05，4)P<0.01

组别 n/只 LVSP/mmHg LVEDP/mmHg ＋(dp/dt)max/(mmHg·s-1) －(dp/dt)max/(mmHg·s-1)Sham 15 137.26±11.55 4.18±1.76 4 324.64±465.19 4 237.06±381.92 MI-Sed 15 78.39±9.754) 11.47±2.964) 2 478.28±215.274) 2 034.18±194.554)MI-Ex 15 108.35±13.202)3) 7.55±1.692)4) 3 674.82±298.352)4) 2 838.48±251.622)4)

2.2 心肌糖原、FA和乳酸含量的变化

与 Sham组比较，MI-Sed组糖原质量分数降低(P<0.01)，FA浓度和乳酸质量摩尔浓度升高(均为P<0.01)；与 MI-Sed组比较，MI-Ex组糖原质量分数升高(P<0.05)，FA浓度和乳酸质量摩尔浓度下降(均为P<0.01)(见表 3)。

表3 大鼠心肌糖原质量分数、FA浓度和乳酸质量摩尔浓度的变化

表3 大鼠心肌糖原质量分数、FA浓度和乳酸质量摩尔浓度的变化

与MI-Sed组比较，1)P<0.05，2)P<0.01；与Sham组比较，3)P<0.05，4)P<0.01

组别 n/只 w(糖原)/(mg·g-1) c(FA)/(mmol·L-1) b(乳酸)/(μmmol·g-1)Sham 15 4.17±1.30 0.62±0.08 122±27 MI-Sed 15 2.35±0.764) 1.75±0.284) 314±514)MI-Ex 15 3.78±0.621) 0.71±0.122) 233±352)4)

2.5 心脏组织病理学改变

Masson染色显示。Sham组心肌细胞着色均匀，无明显胶原成分。MI-Sed组心肌纤维化程度明显，只有少量心肌细胞。MI-Ex组较 MI-Sed组心肌细胞增多，胶原纤维显著减少(见图1)。

图1 各组心肌组织病理学变化

2.6 心肌PPARα和CPT-1 mRNA的变化

心肌PPARα和CPT-1 mRNA的变化规律一致，即MI-Sed组显著低于Sham组(P<0.01)，MI-Ex组显著高于MI-Sed组(P<0.01)(见图2)。

图2 心肌PPARα和CPT-1 mRNA的变化

2.7 心肌总AMPKα、p-AMPKα、GLUT4和PGC-1α蛋白的变化

心肌总 AMPKα蛋白在各组差异无显著性(P>0.05)。p-AMPKα在 MI-Sed组高于 Sham 组(P<0.05)，MI-Ex组则分别高于MI-Sed组和Sham组(P<0.01)。GLUT4和 PGC-1α变化趋势一致，即在MI-Sed组低于 Sham 组(P<0.01)，在 MI-Ex组高于MI-Sed 组(P<0.01)(见图 3)。

图3 心肌总AMPKα、p-AMPKα、GLUT4和PGC-1α蛋白的变化

3 讨论

本研究探讨了长期有氧运动对HF大鼠心肌能量代谢的影响发现，运动通过活化AMPK，上调下游靶分子(GLUT4、PPARα、CPT-1和PGC-1α)的基因表达，进而促进 FA利用、葡萄糖摄取与有氧氧化、线粒体生物合成增加、心肌有氧代谢能力提高，减少了心脏脂质沉积与乳酸堆积，因此改善了HF后心脏代谢性重塑并提高心功能。

3.1 HF后心肌代谢性重塑及运动的良性效应

本研究成功建立心梗后HF模型，即MI-Sed组表现出典型的心梗后心室舒缩功能下降(LVSP、±(dp/dt)max显著性下降，LVEDP则显著性升高)，同时心肌糖原质量分数减少、FA浓度堆积、乳酸升高、线粒体生物合成减少。8周有氧运动后，与MI-Sed组比较，MI-Ex组心功能改善(LVEDP显著性降低，LVSP、±(dp/dt)max显著性升高)，糖原质量分数升高，FA浓度和乳酸质量摩尔浓度下降。上述结果提示，心梗后HF心脏发生代谢性重塑，能量产生减少、酸中毒和脂毒性造成心功能进一步下降，有氧运动则延缓了这一病理过程的发生，这与临床流行病学的研究一致[8-9]。但运动如何通过调节能量代谢进而改善心功能，至今仍不清楚。由于AMPK在心肌能量代谢中起关键作用且运动应激可使其活化[6-7]，因此，推测运动诱导的AMPK上调可能参与了对HF后心肌代谢性重塑的调节。

3.2 运动诱导的AMPK信号通路参与了HF大鼠心肌能量的调节

研究表明，AMPK在心脏的正常发育以及心肌代谢过程中起重要作用，同时对心肌缺血-再灌注损伤起保护作用[5，10]。运动时，AMP与ATP比值升高诱导AMPK活化[6]，因此一次急性运动可活化AMPK[7]，并呈现运动强度依赖性，提示AMPK在心肌能量代谢以及对运动适应中起重要作用，但长期运动训练对病理心脏AMPK表达的影响尚无报道。在本研究中，经过8周运动训练，总AMPKα蛋白在各组差异无显著性，p-AMPKα(AMPK磷酸化后才能被激活，所以只有p-AMPKα具有生物活性)在MI-Ex组显著高于MI-Sed组和Sham组，说明长期有氧运动可持续上调AMPK表达水平，这与长期运动可提高骨骼肌、脂肪与肝脏AMPK活性的研究结果相似[11-12]，同时提示，AMPK在运动改善HF大鼠代谢性重塑中扮演重要角色。

1)运动活化AMPK-PGC-1α信号通路与线粒体生物合成。

正常心肌细胞的主要供能物质是 FA，可产生60%~70%ATP，其余大约30%ATP由葡萄糖代谢供给，因此，线粒体在心肌细胞供能过程中起着至关重要的作用。PGC-1α是调节线粒体生物合成的关键性信号分子，其表达增加激活包括核呼吸因子(NRFs)及线粒体转录因子A(Tfam)在内的一组转录因子，启动线粒体DNA复制和转录而诱导线粒体生物合成[13]。AMPK作为PGC-1α的上游信号分子，可上调其表达[14]。本研究发现，MI-Sed组PGC-1α蛋白水平显著低于Sham组，提示HF时线粒体生物合成减少，这与前人的研究一致[3]。MI-Ex组p-AMPKα和PGC-1α均较MI-Sed组显著升高，推测长期有氧运动可激活AMPK-PGC-1α信号通路，促进心肌线粒体生物合成[15]。临床研究指出，运动能力下降、易疲劳和肌无力是影响HF患者生活质量的主要因素，这与HF时心输出量和最大摄氧量(VO2max)降低以及有氧代谢能力下降密切相关。而PGC-1α上调使线粒体容积密度增加并与 HF患者VO2max和无氧阈的变化正相关[16]。因此，运动诱导AMPK-PGC-1α上调改善了HF时能量产生，心脏收缩功能和有氧能力(VO2max)随之提高[17]，为代谢性重塑的良性变化奠定了物质基础。

2)运动活化AMPK-PPARα信号通路与FA代谢。

FA是正常心肌安静时的主要能量底物，PPARα能够调控编码心肌线粒体大部分 FA氧化酶的基因表达[18]，其中CPT-1催化长链FA进入线粒体，是决定FA氧化的限速酶之一。最新的研究指出，PPARα是AMPK下游的靶分子，即AMPK可上调PPARα表达，两者构成AMPK-PPARα信号通路，对维持心肌能量代谢稳态发挥重要作用[19-20]。此外，AMPK还可激活PGC1α，PGC1α作为转录协同激活因子，与PPARα结合促进FA代谢酶的表达。

研究证实，压力过负荷HF模型8周后，PPARα mRNA和蛋白水平均显著低于对照组[19]。本研究发现，虽然MI-Sed组AMPK有一定程度升高，但PPARα mRNA在MI-Sed组显著低于Sham组，提示少量活化的AMPK不足以上调PPARα或者存在其他网络式信号转导途径(如PGC1α下调)。伴随CPT-1的表达下调，心肌FA含量显著升高，这是HF时FA利用减少的重要分子机制。HF时FA供能减少，一方面，可减少缺血缺氧状态下心肌氧耗(FA氧化耗氧量多于葡萄糖)，但同时可造成脂质在心脏沉积，诱导心肌细胞凋亡和脂毒性心脏异常。临床研究发现，HF患者心肌内出现明显的脂质沉积，而且心肌细胞间脂质沉积与收缩功能失调及心功能衰竭有关[2]。

耐力运动可上调心脏 PPARα表达水平[21]，与本研究结果一致，即经过8周有氧运动，MI-Ex组PPARα、CPT-1 mRNA水平显著高于MI-Sed组，说明长期有氧运动激活了 AMPK-PPARα信号通路，加之 PGC1 α上调、线粒体生物合成增加使心肌能够更有效的氧化、利用FA供能，心脏FA含量显著降低，减轻了心脏脂质沉积并改善脂毒性心脏异常。

3)运动活化 AMPK-GLUT4信号通路与葡萄糖代谢。

葡萄糖代谢约占正常心肌能量代谢的1/3。AMPK可通过上调 GLUT4表达以及转位而促进葡萄糖摄取并增强糖酵解作用[22]。本研究发现，HF时GLUT4蛋白表达下调，这与Tian等[19]的研究结果一致，他们还发现，虽然GLUT4总蛋白降低，但肌膜上的GLUT4占总蛋白的百分比却增加，提示HF时AMPK代偿性增加可促进 GLUT4向肌膜转位，从而增加葡萄糖摄取。然而由于 GULT4总量减少，GLUT4在肌膜的相对增多并不能满足HF时心肌的能量供应。HF时糖酵解效率明显增强，心肌糖原含量减少，乳酸堆积增多、酸中毒进一步影响心功能[23]。

一次急性运动可上调GLUT4表达[24]，其意义在于通过增强糖酵解作用及时为心肌提供能量(糖酵解供能效率均较 FA和糖有氧氧化高)。但长期运动上调GLUT4表达的意义可能不同于一次急性运动。在本研究中，MI-Ex组GLUT4蛋白水平显著高于MI-Sed组，提示长期有氧运动通过活化AMPK促进GLUT4表达，葡萄糖摄取增加。与此同时，MI-Ex组心肌乳酸含量较MI-Sed组显著性降低(但仍高于Sham组)，说明长期有氧运动促使HF时糖酵解供能向糖有氧氧化供能转变。其可能机制是长期运动通过增加线粒体生物合成、舒张血管(特别是冠状动脉)增加血流量，机体的有氧代谢能力增强，同时FA氧化利用增加又可通过葡萄糖-脂肪酸循环[25]抑制糖酵解的关键酶——丙酮酸脱氧酶和磷酸果糖激酶，使糖酵解供能逐渐转向糖有氧氧化供能。因此，心肌乳酸堆积减少，心功能随之改善。

HF时心肌能量代谢的特点是由优先利用FA转变为糖酵解供能为主并造成酸中毒和脂质沉积，同时线粒体生物合成减少，随着HF发展进程，脂肪酸与葡萄糖的利用均显著下降；运动则使FA氧化、葡萄糖利用以及线粒体生物合成均增加，这是心肌对长期训练适应的结果。

综上所述，长期有氧运动通过激活AMPK及其下游信号通路改善了HF心脏的代谢性重塑并提高运动心功能。

[1] van B M，van N F A，der Vusse G J. Metabolic remodelling of the failing heart: beneficial or detrimen-tal?[J]. Cardiovasc Res，2009，81(3)：420-428.

[2] Sharma S，Adrogue J V，Golfman L，et al. Intramyocardial lipid accumulation in the failing human heart resembles the lipotoxic rat heart[J]. FASEB J，2004，18(14)：1692-1700.

[3] Garnier A，Fortin D，Delomenie C，et al. Depressed mitochondrial transcription factors and oxidative capacity in rat failing cardiac and skeletal muscles[J]. J Physiol，2003，551(Pt 2)：491-501.

[4] Neubauer S. The failing heart-an engine out of fuel[J].N Engl J Med，2007，356(11)：1140-1151.

[5] Kim A S，Miller E J，Young L H. AMP-activated protein kinase: a core signalling pathway in the heart[J].Acta Physiol (Oxf)，2009，196(1)：37-53.

[6] Coven D L，Hu X，Cong L，et al. Physiological role of AMP-activated protein kinase in the heart: graded activation during exercise[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab，2003，285(3)：E629-636.

[7] Musi N，Hirshman M F，Arad M，et al. Functional role of AMP-activated protein kinase in the heart during exercise[J]. FEBS Lett，2005，579(10)：2045-2050.

[8] Keteyian S J. Exercise training in congestive heart failure: risks and benefits[J]. Prog Cardiovasc Dis，2011，53(6)：419-428.

[9] Yeh G Y，McCarthy E P，Wayne P M，et al. Tai chi exercise in patients with chronic heart failure: a randomized clinical trial[J]. Arch Intern Med，2011，171(8)：750-757.

[10] Lopaschuk G D. AMP-activated protein kinase control of energy metabolism in the ischemic heart[J]. Int J Obes (Lond)，2008，32(Suppl 4)：S29-35.

[11] Langfort J，Viese M，Ploug T，et al. Time course of GLUT4 and AMPK protein expression in human skeletal muscle during one month of physical training[J]. Scand J Med Sci Sports，2003，13(3)：169-174.

[12] Takekoshi K，Fukuhara M，Quin Z，et al. Long-term exercise stimulates adenosine monophosphate-activated protein kinase activity and subunit expression in rat visceral adipose tissue and liver[J]. Metabolism，2006，55(8)：1122-1128.

[13] 韩雨梅，张勇. PGC-1α在运动诱导骨骼肌线粒体生物合成中的调控作用[J]. 中国运动医学杂志，2010，29(4)：494-497.

[14] Scarpulla R C. Metabolic control of mitochondrial biogenesis through the PGC-1 family regulatory network[J].Biochim Biophys Acta，2011，1813(7)：1269-1278.

[15] Kemi O J，Hoydal M A，Haram P M，et al. Exercise training restores aerobic capacity and energy transfer systems in heart failure treated with losartan[J]. Cardiovasc Res，2007，76(1)：91-99.

[16] Garnier A，Fortin D，Zoll J，et al. Coordinated changes in mitochondrial function and biogenesis in healthy and diseased human skeletal muscle[J]. FASEB J，2005，19(1)：43-52.

[17] Wisloff U，Loennechen J P，Currie S，et al. Aerobic exercise reduces cardiomyocyte hypertrophy and increases contractility，Ca2+sensitivity and SERCA-2 in rat after myocardial infarction[J]. Cardiovasc Res，2002，54(1)：162-174.

[18] Madrazo J A，Kelly D P. The PPAR trio: regulators of myocardial energy metabolism in health and disease[J]. J Mol Cell Cardiol，2008，44(6)：968-975.

[19] Meng R S，Pei Z H，Yin R，et al. Adenosine monophosphate-activated protein kinase inhibits cardiac hypertrophy through reactivating peroxisome proliferator-activated receptor-alpha signaling pathway[J]. Eur J Pharmacol，2009，620(1-3)：63-70.

[20] Meng R，Pei Z，Zhang A，et al. AMPK activation enhances PPARalpha activity to inhibit cardiac hypertrophy via ERK1/2 MAPK signaling pathway[J]. Arch Biochem Biophys，2011，511(1-2)：1-7.

[21] 方子龙，陈敏，张志文，等. 耐力训练和注射丙酸睾酮对雄性大鼠肝脏、心脏和腓肠肌PPARα表达的影响[J]. 天津体育学院学报，2006，21(3)：197-200.

[22] Bergeron R，Shulman G I. Translocation of myocardial GLUT-4 and increased glucose uptake through activation of AMPK by AICAR[J]. Am J Physiol，1999，277(2 Pt 2)：H643-649.

[23] Dolinsky V W，Dyck J R. Role of AMP-activated protein kinase in healthy and diseased hearts[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2006，291(6)：H2557-2569.

[24] 龚豪杰，谢谨，张楠，等. 不同强度运动对AMPKα2三种不同基因状态鼠MEF2/GLUT4DNA结合活性的影响[J]. 体育科学，2011，31(2)：55-63.

[25] 房冬梅，冯美云. 运动对心肌组织能量代谢的影响[J]. 体育科研，2002，23(4)：16-18.