湘葛一号葛根活性物质提取制备葛根功能饮品研究

熊力夫， 邹亲朋， 叶惠煊， 刘向前

(1.长沙市葛根工程技术研究中心, 湖南 长沙 410005； 2.长沙博海生物科技有限公司， 湖南 长沙 410205； 3.湖南中医药大学， 湖南 长沙 410208)

湘葛一号葛根活性物质提取制备葛根功能饮品研究

熊力夫1， 邹亲朋2， 叶惠煊3， 刘向前3

(1.长沙市葛根工程技术研究中心, 湖南 长沙 410005； 2.长沙博海生物科技有限公司， 湖南 长沙 410205； 3.湖南中医药大学， 湖南 长沙 410208)

以葛根为原料，以葛根素为主要评价指标，研究了葛根中各主要活性成分的含量、葛根黄酮的制备、葛根黄酮饮品的稳定性及极端条件的破坏性、葛根黄酮饮品口感及感官指标、葛根黄酮饮品生产工艺等。结果表明：与泰国葛根、粉葛等相比，湘葛一号葛根中葛根素等活性成分含量明显较高。不同浓度乙醇提取葛根总黄酮，以65%乙醇提取效果最好。湘葛一号天然葛根饮品的制备过程中，低浓度(21.6mg/500mL)、中浓度(216mg/500mL)饮品在不同温度条件下的葛根黄酮均无明显变化，含量稳定；高浓度(360mg/500mL)饮品葛根黄酮含量均有不同程度减少，稳定性稍差；中、高浓度饮品葛根黄酮高温易氧化变色，低温易沉淀析出，故低浓度饮品稳定性最佳。在各浓度葛根饮品中，每500mL含葛根素100mg及以下的葛根饮品颜色透明清亮；每500mL含葛根素2.16mg等低浓度的饮品与纯净水无明显口感差异，21.6mg级别的饮品口感微苦，并有一种清凉感，适合饮用。

葛根； 黄酮； 生产工艺； 功能饮品

葛根(Puerarialobata)是一种药食两用的经济作物，具有极高的营养价值和医药价值，在我国素有“南葛北参”的美誉。葛根为豆科植物湘葛一号 的干燥根，习称湘葛一号。葛根在世界上共有20个品种，中国有12种，种质资源居世界首位。近年来，国内外医学专家对葛根的深入研究表明，异黄酮类化合物是葛根的主要有效活性成分，其中包括大豆甙元、大豆甙、葛根素、大豆素4，7-二葡萄糖甙等，其中葛根素是本属的主要成分及特有成分[1-4]。葛根异黄酮类化合物具有促进心脑血管血液流动、舒张平滑肌角痉、抗癌及诱导癌细胞分化、抗氧化、降血糖、降血脂以及增强机体免疫等作用[5-8]。

我国已生产出以葛根及其提取物为原料的一系列药品，主要制剂有：葛根片、葛根黄酮片、愈风宁心片、葛根素注射液、葛根黄豆甙片等[9-11]。在国际市场上，日本、韩国、泰国及欧美等国每年从中国进口大量的葛根粉，制成葛冻，或加入牛奶制成流质食品、饮料等功能饮食和风味食品，此外在医药和化工领域也被广泛使用。但在国内，葛根资源的开发利用还处于起步阶段，深度和广度不够，没有形成系列的深加工产品。我们以葛根为原料，以葛根素为活性成分和主要评价指标，开发出功能型解渴、保健的湘葛一号天然葛根饮品。

1 材料与方法

1.1 试验材料

湘葛一号葛根、泰国葛根、粉葛、葛根茎叶。

1.2 试验方法

1.2.1 不同品种葛根中各主要活性成分的含量

(1) 水溶性葛根黄酮制备原料的选择: 采用HPLC，以甲醇-水梯度洗脱，以葛根素为主要考察指标，辅助以大豆苷元、大豆苷、染料木素为参考指标，比较各品种中有效成分的含量。

(2) 水溶性葛根黄酮标准品溶液的制备：精密称取葛根素对照品3.53mg，甲醇溶解定容至50mL，微孔滤膜过滤，即得。

(3) 水溶性葛根黄酮样品溶液的制备：分别取泰国葛根、粉葛、湘葛一号、葛根茎叶样品粉末0.1g于锥形瓶中，加30%乙醇50mL，称定重量，于水浴锅中回流30min，补足失重，微孔滤膜过滤，即得。

(4) 色谱条件: 仪器: SHIMADZU SPD — 10A；波长250nm；规格: 柱长150mm，内径4.6mm，粒径5μm;柱温25℃；流速0.8mL/min；流动相: 甲醇 — 水；进样量10μL；梯度洗脱程序见表1。

1.2.2 不同浓度乙醇对葛根总黄酮提取率的影响 取葛根(湘葛一号，下同)粉末3份，每份10g，分别用65%乙醇、30%乙醇、水提取2次，每次8倍量溶剂提取2h，合并2次提取液，分别得提取液130mL、140mL和143mL。以葛根素为考察指标，采用HPLC测定其含量，通过测定结果比较不同浓度乙醇对葛根总黄酮提取率的差异。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Thegradientprogram时间(min)MeOH(%)H2O(%)0208010257515406018～20465422554525653530722835～402080

HPLC测定方法采用《中华人民共和国药典》2010版葛根中葛根素的检测方法。具体方法如下：

(1) 标准品溶液的制备：精密称取葛根素对照品3.53mg，甲醇溶解定容至50mL，微孔滤膜过滤，即得。

(2) 原料样品的制备：取葛根粉末0.1003g于锥形瓶中，加30%乙醇50mL，称定重量，于水浴锅中回流30min，补足失重，微孔滤膜过滤，即得。

(3) 葛根不同浓度醇提取物样品的制备：分别取水、30%乙醇、65%乙醇提取液2mL于50mL容量瓶中，加30%乙醇溶解，定容，微孔滤膜过滤，即得。

(4) 色谱条件： 仪器: SHIMADZU SPD-10A；波长250nm；规格: 柱长150mm，内径4.6mm，粒径5μm；柱温25℃；流速0.8mL/min；流动相: 甲醇 — 水(25∶75)；进样量 10μL。

1.2.3 水溶性葛根黄酮的制备(提取及纯化)[12-15] 采用65%乙醇提取葛根总黄酮，将葛根药材粉碎，过80目筛，通过正交设计实验，采用3因素3水平正交表格，考察浸泡时间、提取溶剂用量、提取时间对提取率的影响，确定加热前浸泡1h，采用10倍量溶剂分别提取1.5h、1h，提取2次，可以获得很好的提取效果。所得提取液可经吸附法精制，初步确定出最佳工艺是用D101大孔吸附树脂作为富集剂,用粗提浸膏8倍量的大孔树脂吸附,用15倍量的体积分数70%乙醇水溶液作为洗脱剂,可以较完全地将葛根素洗脱下来。经聚酰胺柱层析,以水洗脱、 浓缩、 放置析出葛根素粗品，含量可达80%左右。粗品再次经聚酰胺柱层析、 水洗脱、 浓缩析出结晶 ,再经冷冻干燥、喷雾干燥或用体积分数75%左右乙醇重复结晶制得精品,其葛根素含量可达90%以上。

1.2.4 葛根黄酮溶解性试验 拟先对葛根素在水中的溶解度进行研究，采用80%含量葛根素，过量加入水中，超声溶解分散，形成过饱和的葛根素水溶液，发现溶液浑浊，有絮状，离心除去未溶解的葛根素，HPLC测得葛根素在水中的溶解度约为4.6g/L。

以此为基础，分别取葛根素约200mg于10 mL具塞标准口试管中，再于每支试管中加入不同量的不同种类氨基酸、苯甲酸钠等助溶剂，以移液管准确加入10mL蒸馏水，用玻璃棒充分研磨并振摇后，置超声清洗器中振荡，10min后取出离心15min,上清液用微孔滤膜过滤后，取1mL置50mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，采用《中华人民共和国药典》2010版葛根中葛根素的检测方法HPLC测定其含量，每组试验重复测定3次，取其均值。

1.2.5 葛根黄酮饮品稳定性试验及加速破坏性试验 根据《中华人民共和国药典》2010版中葛根和粉葛的推荐使用量和规定的含量要求，配制了每500mL含葛根素2.16mg、10mg、21.6mg、100mg、216mg、360mg及1g的不同浓度葛根饮品。考察其在40℃、常温、0℃、-20℃下的稳定性及低温、高温环境对葛根黄酮的破坏性。重点考察了21.6mg/500mL(低浓度)、216mg/500mL(中浓度)、360mg/500mL(高浓度)3个浓度饮品的稳定性及极端条件的破坏性。

以葛根素为参考指标，通过紫外分光光度法每3d 1次跟踪其葛根黄酮的含量变化情况，并以此初步判断其稳定性和极端条件对葛根饮品的影响。在饮品制备和1个月条件考察结束后，以HPLC准确测定其中葛根素的含量，以便完全判断出其葛根黄酮的变化。

HPLC采用《中华人民共和国药典》2010版葛根中葛根素的检测方法，取葛根饮品40℃、常温、0℃、-20℃低浓度组，微孔滤膜过滤；取葛根饮品40℃、常温、0℃、-20℃中、高浓度组5mL，加水定容至50mL，微孔滤膜过滤；取 80%葛根素10.21mg甲醇定容至50mL，微孔滤膜过滤，测定原料各组分的含量。

1.2.6 过滤方式对葛根饮品中葛根黄酮含量的影响 考察高速离心、活性炭、硅藻土、微孔滤膜(或反渗透膜)对葛根水的影响，采用前述药典HPLC条件测定葛根黄酮含量变化。

2 结果与分析

2.1 不同品种葛根中各主要活性成分的含量

标准品及样品的HPLC图谱如图1所示，结果如表2所示。从表2可以看出，葛根(湘葛一号)中葛根素等活性成分含量明显较高，大豆苷、大豆苷元、染料木素等含量与粉葛相当，且淀粉含量较低，提取较方便，葛根黄酮得率高。粉葛中淀粉含量过高，而葛根素等成分则相对较低，采用回流等传统方法提取时易出现提取液粘度大等问题，需采用离心等方法才能使溶液与药渣分离。

图1 葛根素(a), 大豆苷、大豆苷元和染料木素(b)及葛根样品(c)的HPLC图Fig.1 HPLC profiles of puerarin (a), daidzin, daidzein and genistein (b), and sample (C)

表2 不同品种葛根中各主要活性成分的含量(n=3)Tab.2 thecontentsofactivesubstancesindifferentspeciesofPueraria(mg/g)葛根素大豆苷大豆苷元染料木素泰国葛根1.800.21140.04540.1260粉葛3.782.83820.89980.0211湘葛一号28.973.17190.38410.0096葛根茎叶0.0270.02810.00310.0123

2.2 不同浓度乙醇对葛根总黄酮提取率的影响

不同浓度乙醇提取葛根总黄酮，水提取时出现大量泡沫于烧瓶中，而65%乙醇则可以很好地消除泡沫的产生，提取过程便于控制，提取液粘度小，便于过滤以及溶剂回收等，而随着醇浓度的降低，样品溶液粘度变大，后处理相对较麻烦。

采用1.2.2色谱条件，得到的标准品及各样品的高效液相色谱图如图2所示，经含量计算得到各方法的提取率如表3所示。从图2、表3可以看出，65%乙醇提取效果最好，其次是水，30%乙醇对葛根素的提取效果较差。采用65%乙醇提取具有提取率高，提取过程容易控制，提取液粘度较小，处理简单，溶剂回收容易等优点。

图2 葛根素标准品、药材及不同浓度乙醇提取的葛根提取液样品HPLC图(a标准品，b药材，c 65%乙醇，d 30%乙醇，e水)Fig.2 HPLC profiles of puerarin standard, medicinal material, and the extracts of Pueraria lobata by different concentration of ethanol

表3 不同提取方法对葛根黄酮提取率的影响Tab.3 TheeffectofdifferentextractingmethodsontheextractionpercentofflavonefromPuerarialobata名称样品量稀释倍数峰面积含量提取率对照品3.53mg 50mL2174787.70.0706mg/mL—原药材10.1003g50mL2123002.534.36mg/g36.64mg/g(含量平均值)原药材20.1050g50mL2517012.038.91mg/g65%乙醇10.0g130mL*253086049.332.56mg/g88.86%30%乙醇10.0g140mL*252475914.628.13mg/g76.78%水10.0g143mL*252532382.229.39mg/g80.21%

2.3 葛根黄酮溶解性

葛根黄酮溶解性试验表明，赖氨酸(0.005mol/L)、组氨酸(0.005mol/L)、精氨酸(0.005mol/L)和苯甲酸钠(0.05mol/L)等对葛根素有明显的助溶作用，在该浓度下可使葛根素在水中的溶解度提高1倍左右。通过查找《中华人民共和国药典》(2010版)，葛根和粉葛的用量为9～15g，以葛根素含量较高的湘葛一号计，其使用量下葛根素的含量约为216～360mg，完全可以不添加任何助溶剂而溶解于500mL纯净水中。

试验研究还发现，葛根黄酮并不能迅速溶解于水中，加快溶解的方法主要有加热、超声、搅拌、振荡等，超声可显著加快葛根黄酮的溶解，加热亦因温度上升葛根黄酮在水中的溶解度增大而溶解加快。溶解后的葛根素室温下一般不易析出，实际生产中可采用配制浓缩液再加入至纯净水中稀释至目标浓度再过滤或倒入葛根黄酮粉末加热搅拌的方式加速溶解。助溶剂的加入有助于提高葛根黄酮的溶解度以及保持其溶解后在溶液中的稳定性，但并不能明显加速葛根黄酮的溶解速率。

2.4 葛根黄酮饮品稳定性

以葛根素为参考指标，采用紫外分光光度法测定葛根黄酮的含量变化结果如表4所示，其中UV所得值为标准品、样品和高浓度饮品稀释50倍，低浓度及中浓度饮品稀释25倍后测定的值。

表4 葛根饮品中葛根黄酮含量测定的UV值Tab.4 ThecontentchangeofflavoneinPuerarialobatadrinks天数标准原料低浓度饮品(21.6mg/500mL)中浓度饮品(216mg/500mL)高浓度饮品(360mg/500mL)-20℃0℃室温40℃-20℃0℃室温40℃-20℃0℃室温40℃10.1190.1280.1730.1670.1580.1671.7421.7691.7761.7711.4351.4321.4361.44040.1560.1560.1541.7601.7781.7701.4341.4381.42970.1660.1680.1651.7621.7721.7671.4361.3671.438100.1780.1780.1701.7551.7811.8401.4311.5031.432130.1760.1780.1721.7691.7731.7961.4351.4391.396160.1750.1770.1741.7711.7731.7811.4361.4311.476190.1980.1780.1941.7861.8131.8201.3531.4261.381220.1750.1770.1811.7761.7851.8021.4151.4231.422250.1720.1730.1701.8721.7941.8381.4111.4531.436280.1780.1780.1701.7551.7811.8401.4311.5031.432310.1200.1260.1710.1710.1710.1701.2501.69110.7311.7500.9551.3551.3531.376

从表4可以看出，低浓度组葛根黄酮含量在-20℃、0℃、常温及40℃条件下均一直稳定。1个月以后观察，发现40℃的中、高浓度组与常温、0℃、-20℃相比，饮品颜色明显加深，应该是黄酮类化合物高温下的氧化反应所致，而-20℃条件下的中、高浓度组出现了白色沉淀，葛根素在低温下从水中析出。

HPLC检测结果如表5 、表6所示(中、高浓度稀释10倍测定)。从表5、表6可以看出，在考察时间内，低、中浓度组不同条件下的葛根黄酮含量均无明显变化，含量稳定；高浓度组均有不同程度减少，稳定性稍差；中、高浓度组高温易氧化变色，低温易沉淀析出，故低浓度组稳定性最佳。

表5 不同条件下各浓度饮品活性成分的保留时间、峰面积表Tab.5 Theretentiontimesandpeakareasofactivesubstancesindifferentconcentrationdrinksunderdifferentconditions名称葛根素大豆苷大豆苷元染料木素时间(min)峰面积时间(min)峰面积时间(min)峰面积时间(min)峰面积葛根素20.2231849056.8——————混合标样——22.1781440677.830.7492436923.932.7073266412.680%样20.2314222123.022.144 1194.030.68911211.132.62216510.4低浓度-20℃20.0661202625.8——30.6098091.332.49914560.6低浓度0℃20.0431108452.0——30.6615492.432.56616707.1低浓度室温20.0861203471.4——30.5955394.732.57116836.8低浓度40℃20.1381154829.8——30.6772446.832.57513901.6中浓度-20℃19.9471174654.2——32.36811133.2中浓度0℃20.0641193425.9——30.62278433.832.57220662.3中浓度室温20.0641186595.8——30.62077561.532.55620178.5中浓度40℃20.0941230810.7——高浓度-20℃21.4371625297.2——32.2357581.333.904 2867.3高浓度0℃20.0321830162.3——30.6011079.932.46026314.2高浓度室温20.0321823873.7——30.59511021.232.45826158.7高浓度40℃20.0861858930.6——30.59011657.832.65718618.2

2.5 葛根黄酮饮品口感及感官指标

加入白色的葛根素含量80%的葛根黄酮后，每500mL含葛根素100mg及以下的葛根饮品颜色透明清亮，与纯净水的颜色基本无差别，而100mg以上的饮品则颜色随浓度的增加而加深，216mg时有弱淡黄色，而1g时可明显看见完全不同的黄色。在考虑存储温度时，以1个月为考察期，0℃和室温(20～30℃左右)对葛根饮品的颜色没有明显影响，而-20℃时21.6mg以上浓度饮品组因溶解度降低而导致有不同程度的白色沉淀析出，40℃时21.6mg以上浓度的葛根饮品颜色与刚配制时相比明显加深，这是葛根黄酮在高温下易被氧化所致。

表6 不同条件下各浓度饮品活性成分的含量变化Tab.6 Thecontentchangeofactivesubstancesindifferentconcentrationdrinksunderdifferentconditions(mg/mL)样品名称起始结束葛根素标准品0.07060.0706低浓度葛根饮品-20℃0.04300.0459低浓度葛根饮品0℃0.04300.0423低浓度葛根饮品室温0.04300.0459低浓度葛根饮品40℃0.04300.0441中浓度葛根饮品-20℃0.44850.4485中浓度葛根饮品0℃0.44850.4557中浓度葛根饮品室温0.44850.4531中浓度葛根饮品40℃0.44850.4696高浓度葛根饮品-20℃0.74790.6206高浓度葛根饮品0℃0.74790.6987高浓度葛根饮品室温0.74790.6964高浓度葛根饮品40℃0.74790.7098

在各浓度的葛根饮品中，每500mL含2.16mg等低浓度的饮品与纯净水无明显口感差异，21.6mg级别的饮品口感微苦，并有一种清凉感，适合饮用，而100mg及以上饮品则明显带有苦味，口感较差，不建议采用，或加入添加剂以掩盖黄酮苦味。温度对饮品的口感影响不大。

2.6 过滤方式对葛根饮品中葛根黄酮含量的影响

试验表明，活性炭、硅藻土等吸附方式对葛根黄酮的吸附较大，不宜采用，高速离心和微孔滤膜过滤对葛根黄酮含量影响不大(以葛根素为参考指标)。其中，水纯化工艺中常用的微孔滤膜或反渗透膜对葛根黄酮的含量影响如表7所示。

表7 过滤方式对葛根饮品中葛根黄酮含量的影响Tab.7 TheeffectoffiltermethodontheflavonecontentofPuerarialobatadrink理论含量(mg/mL)过滤后(mg/mL)得率(%)标准品0.07060.0706—低浓度饮品0.045850.043099.83中浓度饮品0.46170.448597.15高浓度饮品0.74920.747993.74

3 结论与讨论

(1) 与泰国葛根、粉葛等品种相比，湘葛一号葛根中葛根素等活性成分含量明显较高。

(2) 不同浓度乙醇提取葛根总黄酮，以65%乙醇提取效果最好。

(3) 湘葛一号天然葛根饮品的制备过程中，低、中浓度组在不同温度条件下的葛根黄酮均无明显变化，含量稳定；高浓度组葛根黄酮含量均有不同程度减少，稳定性稍差；中、高浓度组葛根黄酮高温易氧化变色，低温易沉淀析出，故低浓度组稳定性最佳。

(4) 加入葛根素含量80%的葛根黄酮后，每500mL含葛根素100mg及以下的葛根饮品颜色透明清亮，与纯净水的颜色基本无差别。在各浓度葛根饮品中，每500mL含葛根素2.16mg等低浓度的饮品与纯净水无明显口感差异，21.6mg级别的饮品口感微苦，并有一种清凉感，适合饮用。

(5) 活性炭、硅藻土等吸附方式对葛根黄酮的吸附较大，不宜采用。但高速离心和微孔滤膜过滤对葛根黄酮含量影响不大。

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(文字编校：张 珉)

ActivesubstancesextractionandpreparationfromPuerarialobataforthefunctiondrink

XIONG Lifu1, ZOU Qingpeng2, YE Huixuan3, LIU Xiangqian3

(1.Pueraria Engineering Research Center of Changsha City, Changsha 410005, China; 2.Changsha Bohai Biotech Co.,Ltd., Changsha 410205, China; 3.Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China)

UsingPuerarialobataas raw material and puerarin as evaluation index, the main active substances contents and flavone preparation ofPuerarialobata, the stability and destructibility, the taste and sensory index, and the production technology of flavone drink fromPuerarialobatawere researched. The result showed that, the puerarin content ofPuerarialobatawas obviously higher compared toPuerariathomsonii,PuerariaMirifica. The total flavone ofPuerarialobataextracted with 65% ethanol had the best extract effect. The contents of flavone in low concentration (21.6 mg/500 mL) and medium concentration (216 mg/500 mL)Puerarialobatadrinks were stable under different temperature conditions, while the content of flavone in high concentration (360 mg/500 mL) drink decreased with poor stability. ThePuerarialobataflavone of medium concentration and high concentration drinks were easy to oxidize and change colour under high temperature and easy to precipitate under low temperature, so the low concentration drink had the best stability. The colour ofPuerarialobatadrinks contained puerarin 100 mg and below in 500 mL was transparent and clear, the taste of low concentration drink contained puerarin 2.16 mg in 500 mL had no significant difference with pure water, and the taste of drink contained puerarin 21.6 mg was bitter and cool that was suitable for drinking.

Puerarialobata; flavone; production technology; function drink

2013 — 05 — 17

国家科技支撑计划(2012BAD20B05-04)。

TS 275.4

A

1003 — 5710(2013)04 — 0033 — 06

10. 3969/j. issn. 1003 — 5710. 2013. 04. 009