抗生素及防腐剂在油茶组织培养中的抑菌效应研究

王 瑞， 陈永忠， 罗 健， 陈隆升， 彭邵锋，王湘南， 马 力， 杨小胡

(1.国家油茶工程技术研究中心， 湖南 长沙 410004； 2.湖南省林业科学院， 湖南 长沙 410004)

抗生素及防腐剂在油茶组织培养中的抑菌效应研究

王 瑞1,2， 陈永忠1,2， 罗 健1,2， 陈隆升1,2， 彭邵锋1,2，王湘南1,2， 马 力1,2， 杨小胡1,2

(1.国家油茶工程技术研究中心， 湖南 长沙 410004； 2.湖南省林业科学院， 湖南 长沙 410004)

针对油茶组织培养过程中的细菌污染问题，在继代培养基中分别添加不同种类和质量浓度的抗生素和防腐剂，结果表明： (1)培养基中添加链霉素20mg/L抑菌效果最佳，污染率为0，其次为青霉素G钠盐、青霉素G钠盐+四环素、四环素，多粘菌素B抑菌效果最差； (2)采用苯甲酸钠、山梨酸钾作为抑菌剂，污染率均在92%以上； (3)以添加抗生素链霉素20mg/L的培养基苗木生长状况最佳，增殖系数为3.69，叶片数为3.73，苗木生长量为2.20cm。

油茶； 组培苗； 抗生素； 防腐剂； 抑菌效应

真菌和细菌污染已成为植物组织培养的限制因子，其中细菌污染是最严重的，染菌的组培苗很难生根，即使生根，移栽成活率也很低，污染在植物组培中造成的危害很大[1-2]。组织培养过程中污染的防治一般是用抗生素[3-5]，不同的植物所选用抗生素种类及浓度也不一样，Young等[6]研究表明培养基中加入浓度分别为25、25、6和6mg/L的头孢菌素、四环素、利福平和多粘菌素B的混合物，苹果和杜鹃污染组培苗中细菌完全被消除；田永亮等[7]发现葡萄污染组培苗，四环素的抑菌作用比青霉素的抑菌作用好；周俊辉等[8]研究了丙酸钠和磷酸钠对污染试管苗的影响，0.3%丙酸钠抑菌效果较好；马翠萍[9]发现0.14%苯甲酸和0.16%山梨酸效果最佳，且对组培苗生长的抑制作用不大。

油茶是我国重要的木本油料树种，油茶组培快繁技术对缓解油茶苗木紧张、加快油茶产业发展意义重大[10-12]。细菌污染在油茶组培中也较常见，但大多报道是关于油茶外植体灭菌技术的研究[13-15]，至今未曾见过关于油茶组培苗细菌污染防治的研究。我们研究了抗生素及防腐剂对油茶组培苗细菌污染的防治，旨在为建立无细菌干扰的油茶组培快繁体系提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选用已污染细菌的油茶组培苗。抗生素分别采用多粘菌素B(Polymyxin B Sulfate)、青霉素G钠盐(Penicinllin G sodium)、链霉素(Streptomycin)、四环素(Tetracycline)，防腐剂分别采用苯甲酸钠(Sodium benzoate)、山梨酸钾(Potassium sorbate)。

1.2 试验设计与方法

1.2.1 试验设计

(1) 不同种类抗生素的抑菌效果试验。4种抗生素及其质量浓度水平见表1，以不加抗生素的培养基为对照。每个处理5瓶，每瓶6个外植体，3次重复。

表1 抗生素的种类及质量浓度Tab.1 Sortsandconcentrationsofantibiotics处理号抗生素种类质量浓度(mg/L)1多粘菌素B 52多粘菌素B103青霉素G钠盐104青霉素G钠盐205链霉素106链霉素207四环素108四环素209青霉素G钠盐+四环素10+1010青霉素G钠盐+四环素20+2011CK

(2) 不同种类防腐剂的抑菌效果试验。2种防腐剂及其质量浓度水平见表2，以不加防腐剂的培养基为对照。每个处理5瓶，每瓶6个外植体，3次重复。

1.2.2 试验方法 将带菌的继代油茶组培苗接种于添加不同种类和质量浓度抗生素和防腐剂的继代培养基上(WPM+BA 3.0mg/L+IBA 0.5mg/L)，添加蔗糖30g/L、琼脂6g/L，pH 5.8。抗生素溶液在超净工作台上以0.22μm无菌微孔滤膜过滤后，根据设计浓度按所需量加入已灭菌尚未凝固的培养基中，并分装。培养40d后调查每个处理的芽苗污染数、增殖系数及苗木生长情况。

表2 防腐剂的种类及质量浓度Tab.2 Sortsandconcentrationsofpreservatives处理号防腐剂种类质量浓度(mg/L)1苯甲酸钠0.22苯甲酸钠0.43苯甲酸钠0.64山梨酸钾0.55山梨酸钾1.06CK

1.3 数据处理

采用DPS分析软件进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 抗生素对油茶组培苗的抑菌效果

多粘菌素B、青霉素G钠盐、链霉素、四环素等4种不同浓度的不同抗生素对油茶组培苗抑菌效果见表3。从表3可知，不同种类及不同浓度抗生素处理间油茶组培苗污染率存在极显著差异(F=7.6700，p=0.0001)，不同种类的抗生素，随浓度的增加，污染率降低，抑菌效果增强。链霉素抑菌效果最佳，其次为青霉素G钠盐、青霉素G钠盐+四环素、四环素，多粘菌素B抑菌效果最差。

培养基同时添加青霉素G钠盐和四环素，污染率分别为43.34%、8.35%，其污染率虽低于添加四环素的培养基，但高于添加青霉素G钠盐的培养基，说明这两种抗生素联用不能起到协同作用。处理2～10污染率均低于对照，以处理6(链霉素20mg/L)抑菌效果最好，污染率为0。

表3 不同抗生素处理间油茶组培苗污染率差异性比较Tab.3 Comparisonofdifferentiationofcontaminationrateondifferentsortsandconcentrationsofantibiotics处理号抗生素种类质量浓度(mg/L)污染率均值(%)1多粘菌素B 5100.00aA 2多粘菌素B1063.34abcAB3青霉素G钠盐1026.68cdeBCD4青霉素G钠盐203.34deD5链霉素1075.00abAB6链霉素200.00eD7四环素1060.00bcABC8四环素2013.34deCD9青霉素G钠盐+四环素10+1043.34bcdBCD10青霉素G钠盐+四环素20+208.35deCD11CK100.00aA

2.2 防腐剂对油茶组培苗的抑菌效果

苯甲酸钠、山梨酸钾等2种不同浓度的不同防腐剂对油茶组培苗抑菌效果见表4。从表4可知，不同种类及不同浓度防腐剂处理间油茶组培苗污染率不存在显著差异(F=0.930 0，p=0.479 3)，采用苯甲酸钠、山梨酸钾作为抑菌剂，污染率均在92%以上，说明防腐剂对油茶组培苗抑菌效果差，不宜用作油茶组培苗的抑菌剂。

表4 不同防腐剂处理间油茶组培苗污染率差异性比较Tab.4 Comparisonofdifferentiationofcontaminationrateondifferentsortsandconcentrationsofpreservatives处理号防腐剂种类质量浓度(mg/L)污染率均值(%)1苯甲酸钠0.296.662苯甲酸钠0.492.003苯甲酸钠0.692.004山梨酸钾0.5100.005山梨酸钾1.0100.006CK100.00

2.3 抗生素对油茶组培苗分化、生长的影响

添加不同抗生素的培养基上油茶组培苗的增殖系数、叶片数及苗木生长量见表5。经方差分析，不同抗生素处理间苗木增殖系数、叶片数、苗木生长量均存在极显著差异(苗木增殖系数F=10.475 0，p=0.0001；叶片数F=3.899 0，p=0.000 9；苗木生长量F=13.545 0，p=0.000 1)。

从表5可知，处理1～10油茶组培苗各项指标均高于对照，说明抗生素的添加不会影响已污染组培苗的生长。增殖系数以处理6(链霉素20mg/L)最佳，为3.69；叶片数以处理8(四环素20mg/L)最佳，为4.30；苗木生长量以处理8(四环素20mg/L)最佳，为2.28cm，处理6次之，为2.20cm，两者间不存在显著差异。综合上述分析，以处理6(链霉素20mg/L)苗木生长状况最佳。

表5 不同抗生素处理间油茶组培苗增殖系数、叶片数、苗木生长量差异性比较Tab.5 Comparisonofdifferentiationofmultiplicationcoefficient,leafnumber,growthincrementofseedlingsondiffer-entsortsandconcentrationsofantibiotics处理号抗生素种类质量浓度(mg/L)增殖系数均值叶片数均值苗木生长量均值(cm)1多粘菌素B51.27fE3.82abAB0.92cC2多粘菌素B101.70efDE3.13bcBCD1.13bcC3青霉素G钠盐102.40cdeBCD2.69cdCD1.16bcC4青霉素G钠盐202.07deDE3.20bcBCD1.11bcC5链霉素102.50bcdBCD3.07bcdB-CD0.93bcC6链霉素203.69aA3.73abABC2.20aA7四环素103.13abAB3.53ab-cABC1.90aAB8四环素203.17abAB4.30aA2.28aA9青霉素G钠盐+四环素10+103.04abcABC3.65abABC2.15aA10青霉素G钠盐+四环素20+202.19deCD3.60abABC1.38bBC11CK1.21fE2.24dD0.86cC

2.4 防腐剂对油茶组培苗分化、生长的影响

添加不同防腐剂的培养基上油茶组培苗的增殖系数、叶片数及苗木生长量见表6。经方差分析，不同防腐剂处理间苗木增殖系数及叶片数均不存在显著差异(苗木增殖系数F=1.264 0，p=0.311 6；叶片数F=1.949 0，p=0.123 3)，苗木生长量存在显著差异(F=2.949 0，p=0.032 6)。

从表6可知，处理1、3的增殖系数大于对照，以处理1最佳，为1.41，处理3次之，为1.35；叶片数以处理3最佳，为2.86；苗木生长量以处理3最佳，为1.10cm。综合上述分析，以处理3(苯甲酸钠0.6mg/L)苗木生长状况最佳。

表6 不同防腐剂处理间油茶组培苗增殖系数、叶片数、苗木生长量差异性比较Tab.6 Comparisonofdifferentiationofmultiplicationcoefficient,leafnumber,growthincrementofseedlingsondiffer-entsortsandconcentrationsofpreservatives处理号防腐剂种类质量浓度(mg/L)增殖系数均值叶片数均值苗木生长量均值(cm)1苯甲酸钠0.21.412.58a1.05ab2苯甲酸钠0.41.082.53ab1.05ab3苯甲酸钠0.61.352.86a1.10a4山梨酸钾0.51.102.73a1.05ab5山梨酸钾1.01.001.63b0.81c6CK1.212.24ab0.86bc

3 结论与讨论

(1) 在培养基中添加一定浓度的单一种类的抗生素，能够有效抑制油茶组培中外植体与培养基接触处产生的白色水渍状细菌污染。本研究中，链霉素抑菌效果最佳，培养基中添加链霉素20mg/L可使油茶组培苗污染率降为0，其次为青霉素G钠盐、青霉素G钠盐+四环素、四环素，多粘菌素B抑菌效果最差。青霉素G钠盐+四环素两种抗生素联用未起到协同作用，未降低污染率，与翟建中、周俊辉等研究结果不同[16-19]。

(2) 采用苯甲酸钠、山梨酸钾作为抑菌剂，污染率均在92%以上，说明防腐剂对油茶组培苗抑菌效果差，不宜用作油茶组培苗的抑菌剂。

(3) 不同抗生素对油茶组培苗分化、生长的影响，以添加链霉素20mg/L的培养基苗木生长状况最佳，增殖系数为3.69，叶片数为3.73，苗木生长量为2.20cm。不同防腐剂对油茶组培苗分化、生长的影响，以添加苯甲酸钠0.6mg/L的培养基苗木生长状况最佳，增殖系数为1.35，叶片数为2.86，苗木生长量为1.10cm，其苗木生长状况差于添加抗生素链霉素20mg/L的培养基。

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(文字编校：张 珉)

BacteriostaticefficacyofantibioticandpreservativeintissuecultureofCamelliaoleifera

WANG Rui1,2, CHEN Yongzhong1,2, LUO Jian1,2,CHEN Longsheng1,2, PENG Shaofeng1,2, WANG Xiangnan1,2, MA Li1,2, YANG Xiaohu1,2

(1.National Oil-tea Camellia Engineering & Technology Research Center, Changsha 410004, China; 2.Hunan Academy of Forestry, Changsha 410004, China)

In order to solve the problem of contamination during the process of tissue culture ofCamelliaoleifera, different sorts and concentrations of antibiotics and preservatives were added to medium separately. The results showed that :(1)Medium adding with streptomycin 20 mg/L was most effective, the contamination rate was 0%, the next were penicillin G sodium, penicillin G sodium + tetracycline, tetracycline, and the effective of Polymyxin B Sulfate was the worst. (2) Medium adding with sodium benzoate and potassium sorbate, the contamination rate was over 92%. (3) Medium adding with streptomycin 20 mg/L was most effective, and the proliferation coefficient was 3.69, leaf number was 3.73, growth increment of seedlings was 2.20 cm.

Camelliaoleifera; tissue culture seedling; antibiotic; preservative; bacteriostatic efficacy

2013 — 05 — 02

长沙市科技计划项目(K1201012-61)；湖南省林业科学院创新基金项目“油茶组培苗生根体系建立及生根机理研究”。

王 瑞(1983 — )，女，山东省东营市人，助理研究员，在读博士，主要从事油茶良种繁育研究。

Q 943.1

A

1003 — 5710(2013)04 — 0025 — 04

10. 3969/j. issn. 1003 — 5710. 2013. 04. 007