铁线莲“茱莉亚”的组织培养研究

吴荣

（西南林业大学 园林学院，云南 昆明650224）

1 引言

铁线莲属（ClematisL.）植物是毛茛科（Ranunculaceae）世界著名的观赏植物，共约300余种，广布全球；我国有110种左右，全国各地都有分布［1］。早在1688年的《花镜》中已有雄蕊瓣化的铁线莲重瓣变种的记载，但栽培育种工作却很少有人做过。该属植物为藤本中的佼佼者，有"攀援植物皇后"的美称，目前国内对铁线莲属植物的研究主要集中在种质资源调查、系统分类研究和栽培繁殖等方面［2］。铁线莲属植物存在结实少或萌发时间长、发芽率低等问题，不宜采用有性繁殖，园林栽培应用受到限制，组织培养方面的研究已逐渐展开［3～5］。“茱莉亚”是铁线莲属栽培观赏植物，使用组织培养技术解决铁线莲属一些植物种类繁育困难的问题，不但能给城市绿地增添一道亮丽风景，还对研究铁线莲属植物种质资源保护以及开发利用有一定的参考价值。

2 材料与方法

春季选取从欧洲引种的2年生“茱莉亚”健壮无病虫害的当年生嫩茎，以其茎段和茎节为外植体进行组织培养。以MS培养基为基本培养基，附加不同浓度的NAA、6－BA和KT来诱导愈伤组织和侧芽。

首先将采好的材料用抹布擦一遍，有绒毛的用胶布粘掉，然后用肥皂水浸泡20min后清水冲洗30min。将材料分成茎段和茎节分装，茎段切成6～8cm长短，茎节以将要接种的部位为中心再加0.5cm长度剪下备用，接种时带入接种室，用75%酒精擦拭装材料的瓶子后放入超净台，再在0.1%L汞溶液中浸泡灭菌3min，无菌水清洗4次以上接种。将接种好的外植体放在温度20～22℃、光照12h/d的环境中进行培养。

3 结果分析

3.1 外植体的选择

外植体的选择及接种到培养基中的形式是进行组织培养建立无菌体系以及植株再生的关键。试验选取＇茱莉亚＇的嫩茎平躺在培养基中，5d后开始膨大，第11 d开始长愈伤，30d的愈伤诱导率为52.8%。竖插在培养基中的外植体有10%左右插入培养基部分发黄枯萎，最后死亡，40%左右没有形成愈伤组织，大约15d左右枯死，大约30%的外植体长出黄色粒状较坚硬的愈伤组织，增殖缓慢。较细的外植体会在接种1d后开始发黑，7d后整个外植体死亡。所以，接种时使外植体平躺比竖插在培养基中的愈伤组织诱导率更高（表1）。

表1 嫩茎粗细程度对成活率的影响

从表1可以看出“茱莉亚”较细全部死亡，而较粗嫩茎的成活率高达96.3%，远远高于较细嫩茎。

3.2 愈伤组织的诱导

将“茱莉亚”的茎节和茎段接种到 MS＋2mg/L6－BA＋0.05mg/L NAA＋1mg/LKT培养基中来比较不同外植体的诱导效果。接种第4d茎节长出侧芽，第5d茎段和茎段基部开始膨大，到第10d开始形成淡黄色至绿色愈伤组织，但是都只在切口处形成少量颗粒状质地较硬、颜色不一的愈伤组织，不适合增殖（表2）。

表2 不同外植体愈伤组织及侧芽诱导情况

从表2中可以看出，“茱莉亚”的茎节和茎段在形成愈伤组织和侧芽上的效果相差比较大，茎段愈伤组织诱导率为64.4%，几乎是茎节的2倍，但是却无法诱导侧芽形成。从侧芽诱导率可以看出，虽然茎节能够诱导出侧芽，但是诱导率比较低，只有18.9%，所以在诱导侧芽方面还有待调整。

3.3 愈伤组织增殖

将“茱莉亚”诱导出愈伤组织的茎段和茎节转接到 MS＋3.0mg/L6－BA＋0.1mg/LNAA＋1.5 mg/LKT和 MS＋3.0mg/L6－BA＋0.1mg/LNAA＋2.0mg/LKT中增殖很快，3d后就能明显观察到愈伤组织的增大，第13d愈伤组织增大1倍，10d后＇茱莉亚＇茎节长出第一个丛生芽，形成的愈伤组织呈黄绿色光泽，质地较软，适合愈伤组织的增殖分化（表3）。

表3 不同KT浓度对外植体的增殖情况

由表3可以看出，不同浓度KT对愈伤增殖效果差异很大，1.5mg/LKT对茎节愈伤组织增殖率可以达到90%而2.0mg/LKT对茎节愈伤组织的增殖率仅有11.7%。由此可见，不是KT浓度越高对愈伤诱导率越有利。1.5mg/LKT对＇茱莉亚＇茎段和茎节的愈伤组织增殖效果相差不大，分别是98.3%和90%。茎节在1.5 mg/LKT和2.0mg/LKT中生长情况相差很大。在2.0mg/LKT中，＇茱莉亚＇继代培养产生的侧芽很少而初代培养出的侧芽长得比较强壮，而且诱导产生了少量丛生芽。

4 结论与讨论

4.1 结论

（1）粗嫩茎的成活率远高于细嫩茎，达到96.3%。可能较粗的嫩茎含营养较多，形成层薄壁细胞多，与培养基接触面大，易于吸收营养，消毒过程中不容易被杀死，存活力强。外植体平放在培养基中愈伤组织诱导率高于竖插。

（2）MS＋2.0mg/L6－BA＋0.05mg/LNAA＋1.0 mg/LKT对“茱莉亚”茎段愈伤组织的诱导优于茎节，达到64.4%，但无法诱导形成侧芽。

（3）MS＋3.0mg/L6－BA＋0.1mg/LNAA＋1.5 mg/LKT适合“茱莉亚”愈伤组织的增殖，不管是茎段还是茎节，增殖率都在90%以上，茎段的增殖率甚至高达98.3%。

4.2 讨论

（1）外植体平躺在培养基中愈伤组织诱导率高于竖插，可能是“茱莉亚”对激素浓度比较敏感，竖插在培养基中部分因切口吸收激素快且浓度过高而抑制生长，最后枯萎死亡；而平躺的外植体与培养基接触面积较大，吸收激素速度及浓度合适，因而促进了生长。

（2）新萌蘖茎段和幼嫩新梢本身含病毒少或无毒，处于植物生理上线、营养生长中心和顶端分生组织，幼年的组织都比老年的组织有较高的形态发生能力［6］，但是幼嫩外植体易损伤，消毒时间不宜过长也不能太短。

（3）在增值过程中KT浓度不是越高越好。1.5 mg/LKT对＇茱莉亚＇的愈伤组织增殖效果很好，对侧芽诱导效果很不明显；2.0mg/LKT对愈伤组织增殖和侧芽诱导效果都不明显，这可能是因为NAA和6－BA协同作用的结果。在植物组织培养中，植物生长调节剂是培养基中必不可少的成分，它能以极微小的量影响植物细胞分化、分裂和发育，影响植物的形态建成、开化、结实、成熟、脱落、衰老和休眠、萌发等许多的生理生化活动。

［1］中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志［M］.北京：科学出版社，1980.

［2］蔡艳飞，李世峰，李 涵，等.中国铁线莲属植物研究进展［J］.中国农学通报，2009，25（4）：195～198.

［3］倪 新，马 毓.红花铁线莲的组织培养［J］.植物学通报，1984，2（2/3）：71～73.

［4］泽仁旺姆，尼 珍，潘 多.西藏甘青铁线莲的再生植株［J］.西藏科技，2002，113（9）：61.

［5］张启香，方炎明，吕 梅，等.铁线莲＇Multi－Blue＇不定芽及体细胞胚发生的初步研究［J］.园艺学报，2007，34（2）：365～368.

［6］李淑瑜.大叶女贞快繁体系研究［D］.河南：河南农业大学，2009.