液相色谱消滞留层技术

李 丹，李祖琨，林 洁，康天怿，康秋梅，徐小平

（四川大学华西药学院，四川 成都 610041）

0 引 言

拥有更高的色谱柱效率一直是人们追求和研究的热点。以色谱理论为基础，根据范式方程（H=A+B/u+Cu），研究人员已经清楚地知道影响塔板高度或柱效率的因素包括涡流扩散（A项）、纵向扩散（B项）和传质过程（C项）。换言之，在传统的高效色谱柱的研究中，如何降低A项中的固定相颗粒粒径和颗粒的规整性已经有效地应用到了目前的色谱柱中，最为典型的包括 2004年 Waters公司推出的 UPLC（ultrahigh performance liquid chromatography）色谱柱和近年各个仪器公司相继推出的超高压色谱柱（HHPLC），都是通过降低颗粒粒径（1.6～2.6μm）实现A项的影响降低以获得更高的柱效率。然而由此要求色谱系统必须具备超高压输液泵才能将流动相强行通过粒径充分降低固定相，就目前的技术而言，这一粒径基本达到填充柱的极限，A项的进一步改善已进入瓶颈。而方程中的B项和C项涉及物质的纵向扩散和传质过程以及吸附-脱附过程，其中扩散相与流速的大小相关，高流速的条件下B项的影响可明显减少，但是会同时造成C项的传质效率降低形成矛盾，如何从B、C项出发提高柱效率是研究的又一途径。根据色谱塔板理论[1-3]，中国科学院成都有机化学研究所戴朝政研究员发表的消除滞留层技术[4]一文中首次提出了在固定相球形吸附剂颗粒内部物质的传输过程和吸附剂颗粒与流动相界面上液膜的物质传输过程均由于吸附剂颗粒表面存在滞流层导致传质效率低下，是影响柱效率提高的关键因素之一，可以采用适当的外加电场消除滞留层，使组份与固定相充分交换，从而消除C项的影响。当C项趋于0时，方程中就只存在A项和B项的影响，柱效率可得以大大提高。同时C项的消除，可使流速获得更大的提升，降低了扩散的影响，不仅对柱效率的改善有利，而且还可以大大提高分析效率，由此，为未来研究如何提高柱效率提供了新途径和思路。由于该理论尚处于理论阶段，需要大量的实验加以验证，本文在消滞留技术的基础上，探讨了外加电压与色谱效率的关系，在优化后的外加电场下流速与柱效率的关系，通过滞留层的消除前后色谱柱效率的变化规律，验证滞留层消除对柱效率的可行性，为研究提高色谱柱效率提供一定的数据基础。

1 实验部分

1.1 仪器与材料

HPLC系统（日本岛津公司），色谱3000工作站（浙江大学）；ODS色谱柱（35mm×3.5mm×5μm；带螺丝冒塑料柱）。绿原酸对照品（Chlorogenic acid）；甲醇（色谱级，Fisher公司）；乙腈（色谱级，JHD公司）。

1.2 原理

色谱柱的二氧化硅（SiO2）与水溶液接触时，硅醇基电离，SiO2表面带负电荷，内相反电荷离子富集于SiO2表面形成双电层结构[5-6]。因此，给双电层施加横向电场，双电层将形成电渗流（EOF）沿SiO2表面向负极移动。静止时，双电层位于滞留层底部，当在色谱柱内施加一个电场，固定相表面的液体会移动，从而导致担体表面的滞留层随之消失[7-10]，即是“消滞留层技术”。当滞留层消失，滞留层对塔板高度的贡献也消失，因此Horvath-Lin方程简化为

当流动相线速度：u>>ω3（Dm/dp）时，

理论最佳线速度：

理论最低塔板高度：

可知，施加电压，消除滞留层，能显著提高柱效和分离速度。

1.3 方法

色谱条件如下。流动相：0.3%甲醇∶乙腈（92∶8）；检测波长：323nm；根据在色谱柱两端施加电压的强度和流速变化，考察绿原酸色谱行为的变化，阐述电压、流速与色谱行为的关系（实验装置见图1）。如图1所示，实验装置中在色谱柱两端安置了变压器，可以变换电压，同时安置了整流器将交流电转换为直流电，使自制色谱柱处于直流电场中。实验中，通过变压器，改变色谱柱两端施加电压的强度，考察电压对绿原酸色谱行为的影响。

图1 消滞留层技术实验装置图

2 结果与讨论

2.1 不同直流电压对色谱行为的影响

色谱条件如下。流动相：0.3%甲醇∶乙腈（92∶8）；检测波长：323 nm；电场产生方式：色谱柱两端连接电源两极。在上述条件下，重复进样3次，考察流速一定时，施加0～120V电压，及0～30V电压时，不同电场强度对供试品色谱行为的影响；也考察了当电压不变时，一定范围内改变流速，对比得到不同电场强度、流速对供试品色谱行为的影响。

2.2 0～120V范围电压对色谱行为的影响

如表1所示，当流速（0.5 mL/min）一定时，施加0～120V范围内不同大小的电压，柱效、柱效提高百分比随施加电压的增大而升高，当外加电压为0～30 V时，柱效提高百分比最大，随后随施加电压的增大而逐渐降低。如图2所示，当施加电压超过90V时，柱效大小开始低于不施加电压时的柱效。推测由于施加适当大小电压消除了滞留层，柱效提高，而过大的电压产生的焦耳热大，柱外效应严重，反而使柱效降低，甚至低于不施加电压时的柱效。

2.3 0～30V范围电压对色谱的影响

进一步在电压0～30 V的小范围考察电压对色谱行为的影响，结果如表2所示。由表2可知，流速一定，施加电压在0～30V时，柱效、柱效提高百分比逐渐提高，施加电压在30 V时，柱效提高百分比达到最大值20.99%。推测由于施加此范围内大小的电压，很好地消除色谱柱滞留层，而此电压产生的焦耳热也较小，因此，柱效总体逐渐提高。

表1 不同电压对色谱的影响（n=3）

图2 柱效与电压的变化关系

2.4 流速对色谱行为的影响

变化流速，分别设定流速为 0.5，1，1.5，2mL/min，对比施加30 V电压与不施加电压的条件下的色谱行为。由图3可知，柱效随流速增大而逐渐降低，施加30V电压比不施加电压时的柱效有所提高，柱效提高百分比在流速为0.5mL/min时最大，其随流速加大也逐渐降低，最后趋于稳定。推测，流速加大而使色谱柱柱效降低，施加30V电压消除了滞留层而使柱效有一定程度升高，因此在施加一定大小电压的情况下，在一定范围内增大流速也能保持高柱效。

3 结束语

结果表明，电场的增加可有效消除固定相表面的双电层，有利于组分在固定相中交换，减小流速对传质交换的影响，是进一步提高柱效率、减少分析时间的一种途径。

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表2 小范围大小的电场强度对色谱行为的影响（n=3）

图3 30V电压加载前后柱效随流速的变化关系

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