龟象膏大鼠皮肤长期毒性实验研究※

高银辉 梁海英 王智慧

(河北省乐亭县医院药剂科，河北 乐亭 063600)

龟象膏是河北省唐山市丰润区中医医院根据临床需要研制出的用于治疗糖尿病足的制剂[1]，其主要成分为龟版、象皮、白及、黄连、地龙、车前子、升药、煅石膏等。为考察其安全性，我们参照新药审批办法中有关毒理学实验技术要求及有关文献，进行了该药的皮肤长期毒性实验研究，为其临床应用和进一步研究开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康SD大鼠154只，体质量200～250 g，雌雄各半，由河南省实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(豫)2005～0001。每只分笼饲养，基础饲料为实验鼠全价颗粒饲料，饮用水为已洁净消毒的水，笼底垫料为已经洁净消毒的锯末，每2 d更换1次。实验室温度21～24 ℃，湿度55%～70%，光照12 h明暗周期。

1.1.2 实验仪器 Biofuge strutos型高速低温离心机(Kendro Laboratory Products)；JY92-2D型超声波细胞粉碎机(宁波新芝科器研究所)；YKH-Ⅰ型液体快速混合器(江西医疗器械厂)；TU-180 紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；RE-52AA型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；FA2104N型普通电子天平(上海民桥精密科学仪器有限公司)；PTHW型电热套(巩义市英峪予华仪器厂)；电热恒温水浴锅(上海医疗器械股份有限公司-医疗器械五厂)；予华SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市英峪予华仪器厂)；CELL-DYN3700全自动五分类血球分析仪(日本光电)；HITACHI7060全自动生化分析仪(日本东芝公司)。

1.1.3 实验药物 龟象膏，药物组成：龟版100 g，象皮粉60 g，白及粉60 g，黄连粉36 g，地龙粉30 g，车前子粉30 g，升药2 g，煅石膏18 g，芝麻油500 g。制备方法：龟版和芝麻油慢火熬12 h，龟版微枯后，细绢滤清复入杓内煎滚纳入白及粉、黄连粉至白及粉变为淡黄色，微火加入地龙粉及车前子粉，微火熬制，捞除残渣，滤过，油液备用，煅石膏、升药采用等量递增法，将升药混入煅石膏中，取羊毛脂50 g，加入上述药油内溶化，待温度降至40～50 ℃时加入象皮粉、升药及煅石膏的混合粉，再加入凡士林适量备用。实验对照品为乳膏赋形剂凡士林。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组 将154只SD大鼠随机分为7组，即空白对照组，完整皮肤高、中、低剂量组及破损皮肤高、中、低剂量组，每组各22只，雌雄各半。

1.2.2 给药方法 各组大鼠背部脊柱两侧剃毛，面积约4 cm2，破损皮肤高、中、低剂量组大鼠用针头在剃毛区皮肤划井字，深浅以渗血为度，造成破损皮肤。完整皮肤不予任何处理。完整皮肤、破损皮肤高剂量组在剃毛区涂龟象膏20 g/(只·d)，中剂量组涂龟象膏10 g/(只·d)，低剂量组涂龟象膏5 g/(只·d)，空白对照组涂乳膏赋形剂凡士林10 g/(只·d)。涂药后用胶布固定，每日1次，连续90 d(每周停药1 d)。

1.3 观察指标

1.3.1 一般情况 给药期和恢复期(停药14 d)内逐日观察各组大鼠外观、行为体征、活动、精神状态、进食、粪便及尿液等情况。每7 d称体质量1次，计算给药前后体质量增减率[体质量增减率=(给药后体质量-给药前体质量)/给药前体质量×100%]。如有中毒反应，如呕吐、排泄物异常及皮肤脓肿病变等，则重点观察，发现死亡或濒死者及时尸检。给药90 d后，每组取14只大鼠(雌雄各半)用戊巴比妥钠麻醉后，心脏采血，检测血常规及血液生化指标，随后做系统尸检及病理检查。各组剩余大鼠在停药14 d后同法处理。

1.3.2 血液学指标 采用心脏采集动脉血方法，收集血液，检测各组大鼠血红蛋白(Hgb)、红细胞计数(RBC)、白细胞计数(WBC)及白细胞分类(包括中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞及嗜酸粒细胞)主要血液学指标。

1.3.3 血液生化指标 在做血液学指标的同时，收集血液，分离血清，检测尿素氮(BUN)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)及血清总胆红素(TBiL)主要生化指标，并进行麝香草酚浊度实验(TTT)。

1.3.4 系统尸检及病理检查 大鼠放血处死后，立即对主要脏器做视观剖检，观察主要脏器及腺体是否有肉眼可见肿大、缩小、色泽及硬度等病变。并取心、肝、脾、肺、肾分别称质量，计算脏器系数[脏器系数=(脏器质量/大鼠体质量)×100%]。完整皮肤高剂量组、破损皮肤高剂量组及空白对照组大鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑、肾上腺、胸腺、甲状腺、子宫、卵巢、睾丸、附睾、直肠、十二指肠、胃及皮肤做病理切片检查。

2 结 果

2.1 一般情况 给药期及恢复期各组大鼠外观、行为体征、活动、精神状态均无明显异常；饮食、粪便及尿液正常，体质量正常增加；无大鼠死亡情况发生，亦无中毒反应。提示龟象膏对正常大鼠及皮肤破损大鼠正常生活无明显影响。

2.2 各组大鼠主要血液学指标比较 见表1。

表1 各组大鼠主要血液学指标比较 ±s

由表1可见，各组大鼠主要血液学指标之间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.2 各组大鼠主要生化指标比较 见表2。

表2 各组大鼠主要生化指标比较 ±s

由表2可见，各组大鼠之间AST、ALT、TBiL、TTT及BUN比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4 各组大鼠给药前后体质量增减率比较 见表3。

表3 各组大鼠给药前后体质量增减率比较 ±s

由表3可见，各组大鼠体质量增减率之间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.5 各组大鼠主要脏器解剖及病理组织学检查 各组大鼠主要脏器心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、肠、肾上腺、甲状腺、睾丸、子宫等肉眼观察其位置、形态、色泽、硬度等均无明显肿大、缩小、色泽、硬度等异常病变情况。完整皮肤高剂量组、破损皮肤高剂量组及空白对照组动物心、肝、脾、肺、肾、脑、肾上腺、胸腺、甲状腺、子宫、卵巢、睾丸、附睾、直肠、十二指肠、胃及皮肤病理检查结果均无异常。

2.6 各组大鼠主要脏器系数比较 见表4。

表4 各组大鼠主要脏器系数比较 %，±s

由表4可见，各组大鼠主要脏器系数比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

3 讨 论

糖尿病合并肢端特别是足部坏死性病变称为糖尿病足(坏疽)，是糖尿病致残性并发症之一。导致糖尿病足的原因有肢端中小血管循环和周围神经病变，引起局部缺血、缺氧及营养功能障碍，加上局部挤压、摩擦、碰撞、皮肤干燥破裂，或合并细菌感染等诸多因素。由于患者对该病缺乏认识，治疗措施不当，病变常在短期内加剧，甚者需行截肢或因合并败血症而死亡[2]。目前，西医综合治疗效果不尽人意。糖尿病足属中医学消渴、脱疽等范畴。中医学认为，湿、毒、热、瘀、虚为其基本病理因素。主要由于寒、湿、毒邪侵淫，气血凝滞，经脉阻滞，或肝肾不足，四肢气血不充，失于濡养而致足(指)焦黑坏死，甚则脱落。临床采用中医药疗法能取得较好疗效，且无明显不良反应[3]。

龟象膏具有润湿、祛腐生肌、解毒、活血通络之效，能对创面深、湿度差、血运差、肉芽生长缓慢的难治性创面起到保湿、促进肉芽生长、加速创面愈合的作用，能快速控制炎症，迅速修复筋膜，提高保肢率，降低致死率，为糖尿病足的治疗提供了一条新思路。龟象膏中龟版滋阴养血；象皮止血敛疮，收敛护肤；白及收敛止血，消肿生肌，助龟版润湿；黄连清热解毒，与龟版配伍，清内外诸火；地龙、车前子有清热结、利水道之效；升药、煅石膏提脓祛腐。诸药合用，共奏润湿、化腐生肌、解毒、活血通络之效。现代药理研究表明，象皮主要成分为蛋白质、氨基酸及微量元素，可以促进表皮细胞的增生、分化，使伤口的pH值变化过程加快，促进伤口愈合[4]；龟版含角质蛋白、脂肪及钙、磷动物胶，局部应用有营养组织细胞、润湿作用，促进肉芽和组织细胞生长[5]。

为能安全地在临床上使用，本实验测定龟象膏长期连续经皮肤给药对实验大鼠的长期毒性，并设置了完整皮肤和破损皮肤组进行实验。完整皮肤主要用于监测药物对大鼠皮肤刺激的敏感性，破损皮肤主要用于监测药物对大鼠皮肤创面愈合的治疗作用[6]。本实验依据长期毒性的实验时间应为临床疗程的2～3倍的原则，最长为3个月[7]，确定本实验连续给药时间为90 d。用龟象膏以高、中、低剂量，分别给予大鼠完整皮肤及破损皮肤，每日1次，连续90 d。在给药期及恢复期内大鼠的一般状况良好，体质量增加，主要血液学指标、生化学指标等均属正常范围，与空白对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。解剖主要脏器，肉眼未见明显改变，病理报告未见病理性病变。表明龟象膏长期连续经皮肤给药对实验大鼠无毒性反应。说明龟象膏在临床剂量下使用是安全的，可初步推断适当延长治疗时间或适当加大给药量亦不会影响其安全性。

[1] 王智慧，赵红心，谷小芳.龟象膏治疗糖尿病肢端坏疽40例疗效观察[J].河北中医，2009，31(11)：1623-1624.

[2] 张振涛.中西医结合治疗糖尿病肢端坏疽的体会[J].中国中医药现代远程教育，2008，6(4)：351.

[3] 邓秀娟.浅谈中医药治疗糖尿病肢端坏疽[J].中国中医药信息杂志，2006，13(1)：92.

[4] 李鋆，李秀兰，张燕玲，等.象皮与拟替代品黄牛皮、水牛皮中蛋白的研究[J].中草药，2007，38(11)：1656-1658.

[5] 汪禄祥，董宝生，刘家富.药用龟板的氨基酸和矿质元素分析[J].广东微量元素科学，2005，12(11)：42-44.

[6] 李太一，申成华，郑善子，等.藜芦乳膏的皮肤毒性实验研究[J].延边大学医学学报，2004，2(27)：118-120.

[7] 贾春蓉，陈如泉.半硫丸药物组成毒性实验研究[J].河北中医，2009，31(8)：1225-1226.