HPLC测定消痔坐浴剂中5－O－甲基维斯阿米醇苷的含量*

★ 田晓东 侴桂新 蓝悠 李晖 (.广东省深圳市第六人民医院 深圳5805;.上海中医药大学中药标准化研究中心 上海0003)

消痔坐浴剂是我院肛肠科根据多年临床经验，经反复实践及总结筛选的一个协定处方，由黄柏、泽泻、黄芩、槟榔、熟大黄、防风等11味中药组成。主要采用熏洗、热敷之法，使药力加热力，直接作用于肛门病变部位，，刺激肛门皮肤，促进血液和淋巴循环，从而达到解毒、消肿、止痛、生肌的作用。为实现制剂的质量控制，保证临床用药安全，进一步提高、完善其质量标准，作者参照有关文献［1－2］，采用HPLC，选择防风特有的有效成分5－O－甲基维斯阿米醇苷的含量作为指标，建立了准确有效的测定方法，对消痔坐浴剂的质量控制有重要意义。

1 仪器与试药

Agilent 1100高效液相色谱仪、DAD检测器、四元泵、Agilent1100工作站(美国 Agilent公司，DE43630806);WT2003H电子天平(常州万泰)，5－O－甲基维斯阿米醇苷对照品(批号:111523－20201007，含量 96.5%，中国药品生物制品检定所)，实验中中药材均购于深圳市一致药材有限公司，甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备 精密称取5－O－甲基维斯阿米醇苷对照品13.27 mg置100 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，再精密量取上述溶液5 mL置50 mL量瓶中加甲醇稀释至刻度，即得(含5－O－甲基维斯阿米醇苷12.81μg/mL)。

2.2 消痔坐浴剂的制备 取黄柏290 g、泽泻290 g、当归 290 g、黄芩 290 g、槟榔 240 g、熟大黄 240 g、生地 240 g、秦艽 240 g、防风 240 g、桃仁 144 g，加水60 000 mL，武火沸后转文火煎15分钟，4层纱布滤出滤液，放凉后分装至100瓶500 mL玻璃瓶中，冷藏备用。

2.3 供试品溶液制备 取消痔坐浴剂，用0.45μm的滤膜滤过，精密量取滤液50 mL，于蒸发皿中水浴上浓缩至5 mL左右，移置50 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度。

2.4 色谱条件及干扰试验 色谱柱:Shimadzu VP2ODS(250 mm ×4.60 mm，5 μm);流动相:乙腈为流动相A，0.1%磷酸水溶液为流动相B，按表1比例进行梯度洗脱;流速:1.00 mL/分;检测波长:254 nm;柱温:30℃;进样量:10 μL。在此条件下，5－O－甲基维斯阿米醇苷与邻峰基线分离，分离度＞5.6，理论板数按5－O－甲基维斯阿米醇苷峰计≥6500。取除防风外的其他几味药，制成缺防风的阴性样品，再按“2.2、2.3”项下方法制成阴性样品溶液，依“2.4”项下色谱条件测定，阴性样品溶液无干扰，说明试验专属性良好，色谱图见图1。

表1 流动相洗脱比例(%)

图1 HPLC色谱图

2.5 线性关系考察 精密量取对照品溶液适量，用甲醇稀释，得浓度为 2.56，5.12，10.25，12.81，19.22，25.62μg/mL的5－O －甲基维斯阿米醇苷系列标准溶液，按2.4项下的色谱条件分别进样10μL，以峰面积值(Y)对进样量(X)进行线性回归，得5－O－甲基维斯阿米醇苷标准曲线方程:Y=2.257×106X －1.834×104(r=0.999 3)。结果表明5－O－甲基维斯阿米醇苷在2.56 －25.62 μg范围内，峰面积与进样量呈良好的线性关系。

2.6 精密度试验 取对照品溶液在“2.4”项色谱条件下进样10 μL，重复进样6次，测定峰面积，5－O－甲基维斯阿米醇苷峰面积的RSD为0.9%。表明试验精密度良好。

2.7 稳定性试验 精密吸取供试品溶液10 μL，分别于 0，2，4，8，12，16，24 小时进样，测得供试品溶液中5－O－甲基维斯阿米醇苷峰面积的RSD为1.7%，表明供试品溶液在24小时内稳定。

2.8 重复性试验 对批号为20120422消痔坐浴剂，按“2.3”项下方法制备6份并测定，结果5－O－甲基维斯阿米醇苷平均含量为12.48 μg/mL，峰面积的RSD为1.49%，结果表明该方法的重复性好。

2.9 加样回收率试验 精密量取已知5－O－甲基维斯阿米醇苷含量的，用0.45 μm的滤膜滤过的消痔坐浴剂50 mL，共6份，滤液分别精密加入含量为128.05 μg/mL(精密称取含量为 96.5%的 5 － O －甲基维斯阿米醇苷对照品13.27 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得)的5－O－甲基维斯阿米醇苷对照品溶液5 mL，分别于蒸发皿中水浴上浓缩至5 mL左右，移置50 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，按“2.4”项下方法测定，计算回收率，结果见表2。

表2 加样回收率试验结果(n=6)

2.10 样品含量测定 按“2.3”“2.4”项下方法制备供试品溶液，注入高效液相色谱仪，记录峰面积，代入线性方程计算，测定样品中5－O－甲基维斯阿米醇苷的含量，结果见表3。

表3 样品含量测定结果

3 讨论

3.1 指标成分的确定 防风作为方中的重要成分，具有祛肠风，利水湿的作用，主要含有色原酮类、香豆素类、挥发油、多糖类等，在色原酮成分中以5－O－甲基维斯阿米醇苷含量最高［3］，故以5－O－甲基维斯阿米醇苷作为本方的质量控制指标。

3.2 流动相的选择 试验比较了甲醇－水、乙腈－水、乙腈－磷酸的不同配比，结果以乙腈－磷酸水流动相时，梯度洗脱为好，样本中的5－O－甲基维斯阿米醇苷能与其他成分实现基线分离，峰形良好。

3.3 含量限度 参照中国药典2010年版一部规定，防风中升麻素苷和5－O－甲基维斯阿米醇苷的总含量≥0.24%［4］，而由深圳市一致药材有限公司提供给我院的中药饮片防风均产自内蒙，其有效成分5－O－甲基维斯阿米醇苷的含量达到0.28%［5］，根据本处方资料，理论含量应不少于13.44 μg/mL，根据所测3批样品中的5－O－甲基维斯阿米醇苷最低含量为11.57 μg/mL，考虑到用水提取的因素，暂定本品中含5－O－甲基维斯阿米醇苷≥10 μg/mL。

本方法测定了三批次消痔坐浴剂煎剂中的5－O－甲基维斯阿米醇苷，处理简便，结果稳定可靠，可为消痔坐浴剂的质量控制和不同配伍比较提供重要参考。

［1］严叶霞.反相高效液相色谱法测定防风通圣丸中5－O－甲基维斯阿米醇苷的含量［J］.中南药学，2012，2(10):101 －103.

［2］姜明明，杨更亮，刘海燕，等.RP－HPLC法测定畅鼻通颗粒中升麻素苷和5－O－甲基维斯阿米醇苷的含量［J］.药物分析杂志，2008，28(9):1459 －1461.

［3］姜艳艳，刘斌，石任兵.高效液相色谱法测定防风色原酮部位中4 种成分含量［J］.北京中医药大学学报，2006，29(2):128.

［4］国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)［M］.北京化学工业出版社，2010:140.

［5］李悦悦，王 慧，陈 俊，等，HPLC法测定防风中升麻苷、升麻素、5－O－甲基维斯阿米醇苷和亥茅酚苷的含量［J］.药学实践杂志，2010，28(6):445 －447.