两类医用清洗剂对铜绿假单胞菌生物膜去除效果的实验研究

朱亭亭 李 涛 张流波

中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所，北京 100021

医用多酶清洗剂是一种含有蛋白水解酶等多种生物酶的清洗剂，能够迅速有效地分解有机物如血液、蛋白质、黏多糖、脂肪及糖类，使蛋白质颗粒分离，悬浮颗粒易被流动水冲净[1]。2004年颁布的《内镜清洗消毒技术操作规范》 要求必须对内镜采用多酶清洗剂进行清洗，这推动了国内多酶清洗剂的应用和推广[2]。但是医用多酶清洗剂与医用不含酶清洗剂相比成本较高，国内对于这两类清洗剂的清洗效果差异报道较少。为了了解两类清洗剂的清洗效果差异，本研究采用生物膜反应器制备铜绿假单胞菌生物膜，利用活菌计数法进行了实验研究。

材料和方法

材料

铜绿假单胞菌（ATCC15442），由中国科学院微生物所提供；CDC生物膜反应器，型号为CBR 90-1DH-Int，由美国Biosurface公司生产；试验载体：聚碳酸酯小圆片，直径1cm，厚度0.3cm；KQ-110E超声波清洗器、DK-450B电热恒温水浴；培养基：胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）、胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）。

多酶清洗剂A（有效成分为发酵酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、细胞酶、表面活性剂,稀释比例 1：126，中性pH值）；

多酶清洗剂B（有效成分为多酶—包含脂肪酶和蛋白酶的协同混合，稀释比例1:100，中性pH值）；

多酶清洗剂C、多酶清洗剂D和多酶清洗剂E（有效成分为表面活性剂和多酶，稀释比例1:100，中性pH值）；

不含酶清洗剂F（含有水，聚醚，聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，二甲苯磺酸钠，阴离子磷酸酯钾盐，乙二胺四乙酸四钠，1,2-苯并异噻唑-3-酮，柠檬酸等，稀释比例为1:630、低泡，pH中性）；

不含酶清洗剂G（是含有阴离子和非离子的清洗剂，稀释比例1：375，pH值平衡配方）；

不含酶清洗剂H（非离子和两性表面活性剂，丙二醇，氢氧化钾，五水偏硅酸钠，乙二胺四乙酸四钠等，稀释比例1:126，Ph值碱性）；

不含酶清洗剂I（是含有阴离子和非离子的清洗剂，稀释比例1:757，pH值碱性）。

方法

1. 菌悬液配制

挑取24h新鲜斜面的3个～5个典型单个菌落，接种于100mL浓度为100mg/L的TSB中，于35℃±2℃条件下，振荡培养20h～24h，使菌液浓度达到108CFU/mL。

2. 铜绿假单胞菌生物膜的制备

参考ASTM E 2562-07的制备方法[3]，选定特定材质的coupon，用超声波清洗后用去离子水清洗，仔细安装在反应杆上。向主反应器中加入500mL浓度为300mg/L的TSB溶液中，完成安装反应器，置于121℃灭菌20min后冷却备用。向主反应器中无菌加入1mL菌悬液后，打开磁力搅拌器，大约125r/min,温度20℃±2℃培养24h。培养24h后，用无菌导管连接储液罐、蠕动泵和废液缸，储液罐中为100mg/L的TSB溶液。打开蠕动泵，流速控制在11.7±0.2mL/min，流动培养24h（见图1）。

3. 试验操作步骤

图1 生物膜反应器连接图示

无菌条件下，取出培养好的载体片，用蒸馏水反复冲洗载体片表面浮游菌，然后将其放入含10mL清洗剂应用液的试管中，于40℃±2℃水浴中放置30min；将载体片取出，并将其放入含5mL0.85%NaCL洗脱液的试管中，于40KHz的超声波清洗器中超声15min后，进行细菌计数，此作为试验组；对照组除用用蒸馏水代替清洗剂外，其余步骤与试验组相同。

4. 除菌率的计算方法

除菌率（%）=（对照组菌落数-试验组菌落数）×100%/对照组菌落数

结果

5种医用多酶清洗剂对铜绿假单胞菌生物膜的平均除菌率分别为9 1.3 3%、99.94%、99.94%、99.92%和96.07%（见表1）； 4种医用不含酶清洗剂对铜绿假单胞菌生物膜的平均除菌率分别为90.19%、99.87%、97.36%和92.51%（见表2）。运用统计软件SPSS对两组除菌率进行非参数检验分析，P=0.2683＞0.05，无显著性差异。试验结果表明，两类清洗剂对铜绿假单胞菌生物膜的去除效果没有差异。

讨论

本次试验的研究结果表明，医用多酶清洗剂和医用不含酶清洗剂对铜绿假单胞菌生物膜的去除效果没有显著性差异。结果分析如下：首先，本次试验选用的两类清洗剂对铜绿假单胞菌生物膜均有显著的去除效果，除菌率均大于90%。应当增加一些清洗效果相对偏差的医用含酶清洗剂和医用不含酶清洗剂以防止统计结果产生偏差。其次，生物膜是由细菌和自身分泌的胞外基质组成，活菌计数法评价两类清洗剂对生物膜的去除效果即为两类清洗剂的除菌率的不同，这一评价不能体现出多酶清洗剂对有机物分解的优势，可见单一的活菌计数法在评价医用多酶清洗剂对生物膜的去除效果方面存在不足，应当结合ATP生物荧光法、染色法、电镜扫描等方法进行综合评价。因此，为获得理想的清洗效果，不同的污染物需要选择不同类型的清洗剂。医用多酶清洗剂的应用范围和清洗效果有待进一步评价。

表1 5种医用多酶清洗剂对铜绿假单胞菌生物膜的去除率

表2 4种医用不含酶清洗剂对铜绿假单胞菌生物膜的去除率

[1]张冬湘，黄琴香，莫云花等.消化内镜多酶清洗的效果评价 [J].中国消毒学学杂志，2009，26（1）：76.

[2]中华人民共和国卫生部.内镜清洗消毒技术操作规范[s].北京；中华人民共和国卫生部，2004.1-4.

[3]ASTM E 2562-07：Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa biofilm Grown with High Shear and Continuous Flow using CDC biofilm Reactor[s].2007.