白鲜碱对HepG2细胞的毒性作用及其机制

郭晓培，李艾芳，张宝旭，2，王 旗，2

(1.北京大学公共卫生学院毒理学系，北京 100191;2.国家中医药管理局中药配伍减毒重点研究室，北京100191)

白鲜皮是芸香科植物白鲜(Dictamnus dasycarpus)的根皮，为常用的传统中药。白鲜碱(dictamnine)是白鲜皮的主要成分之一，又称白鲜胺或白藓碱，属呋喃喹啉类生物碱，在白鲜皮中含量约0.1%[1]。白鲜碱能抑制血小板聚集、松弛血管并降低血压等，具有抗菌、抗病毒和治疗皮肤湿疹和皮肤瘙痒的作用[2－4]。2008 年，Jang 等[5]报道，韩国农村地区患者连续服用白鲜碱水煎剂每日5～6次，连续数日，出现急性肝炎，提示白鲜皮具有潜在急性肝毒性。本实验室研究发现，ig给予ICR小鼠白鲜皮水煎剂，小鼠血清中丙氨酸转氨酶(alanine transaminase，ALT)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)和碱性磷酸酶活性及总胆红素明显升高，并具有一定的剂量效应关系;较高剂量白鲜皮给药48 h后，小鼠肝组织出现大面积中心性坏死。白鲜皮中主要成分之一的白鲜碱单独给药达到一定剂量，也可致ICR小鼠发生急性肝损伤，ALT和LDH活性与对照组相比明显升高(待发表)。上述体内实验结果表明，白鲜碱具有潜在的肝毒性，可能是白鲜皮中的毒性成分。HepG2细胞来源于人肝胚细胞瘤，其所含的生物转化代谢酶与人正常肝实质细胞具有同源性，其分化程度较高，并且保留了较完整且活性稳定的生物转化代谢酶，是研究药物肝毒性常用的细胞模型之一[6－7]。本研究用HepG2细胞研究白鲜碱的肝毒性作用及其毒性机制。

1 材料与方法

1.1 细胞、药物、主要试剂和仪器

HepG2细胞，北京协和细胞资源中心。白鲜碱，中国药品生物制品检定所(批号:200301，纯度≥98%);阳性对照盐酸胺碘酮(amiodarone，AD)和盐酸普萘洛尔(propranolol hydrochloride，PPH)，天津一方科技有限公司;羰基氰化氯苯腙(carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone，CCCP)，北京百灵威化学技术有限公司。Triton X-100和罗丹明123，Sigma公司;MEM培养基，北京清大天一生物科技有限公司;胰蛋白酶、MTT和 HEPES，Amresco公司;ALT、天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、LDH、谷胱甘肽 S-转移酶(glutathione S-transferase，GST)和谷氨酰转肽酶(glutamyltranspeptidase，GGT)活性测定试剂盒，南京建成生物工程有限公司。Multiskan MK3酶标仪，美国 Thermo公司;TE2000-S倒置显微镜和DXM1200F数字摄像机，日本Nikon公司;SW-CJ-1F超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司。

1.2 MTT法测定细胞存活率

将HepG2细胞培养在含10%胎牛血清、青霉素100 kU·L－1和链霉素100 kU·L－1、含 Earle 盐和L-谷氨酰胺的MEM培养基中，置于37℃，5%CO2培养箱，24～48 h换液，每2～3 d传代1次。用无水乙醇溶解白鲜碱，再用不含血清的MEM培养基稀释至所需浓度。取对数生长期的HepG2细胞(3～5)×105L－1接种于96 孔培养板上，每孔200 μl。待12 h细胞完全贴壁以后，吸去上清液，分别加入不同浓度的白鲜碱 200 μl，其终浓度分别为 25，50，100，200，300，400，500 和 800 μmol·L－1，正常对照组为细胞加入等体积无血清培养基，溶剂对照组用等体积的1%无水乙醇代替白鲜碱，作用24 h。每组设5个复孔。用MTT法测定细胞存活率。细胞存活率(%)=加药组A490nm/正常对照组A490nm×100%。

1.3 LDH释放率测定

细胞处理同1.2，白鲜碱的终浓度分别为2.5，5，12.5，25，50，100 和 200 μmol·L－1，每个浓度4个复孔，细胞置于37℃，5%CO2培养箱中培养24 h，吸取细胞上清液 20 μl，然后每孔加入 2%Triton X-100 溶液 200 μl，裂解细胞 1 h，吸取每孔裂解液20 μl，按照试剂盒说明书的方法分别测定细胞培养上清液中LDH的含量和细胞裂解液中LDH的含量，LDH释放率(%)=细胞上清液中LDH含量/(细胞上清液LDH含量+细胞裂解液中LDH含量)×100%。

1.4 细胞形态观察

取对数生长期的HepG2细胞(3～5)×107L－1接种于6孔培养板上，每孔1500 μl。待12 h细胞完全贴壁后，吸去上清液，分别加入白鲜碱1500 μl，终浓度分别为25，50，100和200 μmol·L－1，另设正常对照和溶剂对照组。于37℃，5%CO2培养箱培养24 h后，倒置显微镜下观察细胞形态的变化并拍照。

1.5 细胞培养液中ALT，AST，GST和GGT活性测定

细胞培养同1.2。白鲜碱的终浓度分别为25，50，100 和 200 μmol·L－1，每个浓度 4 个复孔，于37℃，5%CO2培养箱中培养。测定 ALT，AST，GST和 GGT 活性的阳性对照分别为 AD 25 μmol·L－1，AD 25 μmol·L－1，Triton X-10080 μmol·L－1和 PPH 125 μmol·L－1。培养时间分别为 24 h;24 h;4 和24 h及4，24和48 h。培养结束后，吸取上清液，按照ALT，AST，GST和GGT试剂盒方法进行处理后，用酶标仪分别在510 nm(ALT，AST和 GST)或410 nm(GGT)处测定每孔A值，计算细胞培养液中ALT，AST，GST 和GGT含量。

1.6 线粒体膜电位的测定

取对数生长期的HepG2细胞，消化后种于共焦小皿中，细胞密度为 1 ×105L－1，每孔 500 μl，待12 h细胞完全贴壁后，吸出培养液，加入白鲜碱，终浓度分别为25，50，100 和200 μmol·L－1，正常对照和溶剂对照组同1.2，作用HepG2细胞24 h，阳性对照为 CCCP 20 μmol·L－1作用 30 min，PBS 清洗2次，加入终浓度为2 mg·L－1的罗丹明123负载液500 μl，孵育20～30 min后，PBS 清洗2次覆盖贴壁细胞，激光共聚焦扫描显微镜下观察线粒体膜电位的变化。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 白鲜碱对HepG2细胞存活率的影响

如图1所示，与正常对照和溶剂对照组相比，不同浓度的白鲜碱与HepG2细胞作用24 h，细胞存活率随着浓度的增加而降低(r=0.965，P＜0.05)，800 μmol·L－1可使细胞存活率降至 10% 以下。用Origin8.0软件拟合计算 IC50为(283±27)μmol·L－1。

2.2 白鲜碱对HepG2细胞膜的损伤

由表1 看出，白鲜碱在 12.5～50 μmol·L－1时引起HepG2细胞膜损伤，LDH释放率较溶剂对照组显著升高(P＜0.01)，但随着白鲜碱浓度增加，LDH释放率反而降低，与溶剂对照组无显著差异。

Fig.1 Effect of dictamnine on survival of HepG2 cells.HepG2 cells were incubated with dictamnine 25，50，100，200，300，400，500 and 800 μmol·L －1for 24 h.The cell viability was examined by MTT assay.NC:normal control;SC:solvent(1%ethanol)control.Cell viability(%)=A490 nmof drug group/A490 nm of NC group.±s，n=5.

Tab.1 Effect of dictamnine on lactate dehydrogenase(LDH)release in HepG2 cells

2.3 白鲜碱对HepG2细胞形态的影响

如图2所示，HepG2细胞形状无规则，处于增长期时，细胞增殖明显，呈片状生长。白鲜碱作用HepG2细胞24 h，与正常对照和溶剂对照组相比，细胞数目明显减少;白鲜碱浓度为100和200 μmo·lL－1时，细胞死亡漂浮的数量更多，细胞皱缩，散开，脱落。

2.4 白鲜碱对HepG2细胞ALT和AST活性的影响

Fig.2 Effect of dictamnine on morphological changes of HepG2 cells(×100).See Tab.1 for the cell treatment.The morphological changes of HepG2 cells were observed under a contrast microscope.A:normal control;B:1%ethanol;C －F:dictamnine 25，50，100 and 200 μmol·L－1，respectively.

Tab.2 Effect of dictamnine on alanine transaminase(ALT)and aspartate aminotransferase(AST)activity in HepG2 cells

由表2看出，白鲜碱与HepG2细胞作用24 h，与溶剂对照组相比，阳性对照AD 25 μmol·L－1组HepG2细胞培养液中ALT和AST活性明显升高(P＜0.05);白鲜碱 100 和200 μmol·L－1组 ALT 活性显著升高(P＜0.05)，具有浓度依赖关系(r=0.995，P＜0.05);白鲜碱 25～200 μmol·L－1均使AST活性升高，且具有浓度依赖性(r=0.996，P＜0.05)。

2.5 白鲜碱对HepG2细胞GST活性的影响

如表3 所示，阳性对照 Triton X-10080 μmol·L－1与HepG2细胞作用4和24 h，与其对应的溶剂对照(0.4%DMSO)组相比，GST活性明显升高(P＜0.05，P＜0.01)。白鲜碱 25 和 50 μmol·L－1与HepG2细胞作用4 h，GST活性与其对应的溶剂对照(1%乙醇)组相比无明显变化;100 和200 μmol·L－1时，GST活性明显升高(P＜0.01);白鲜碱50～200 μmo·lL－1与HepG2细胞作用24 h，GST活性均明显升高(P＜0.05，P＜0.01)。

Tab.3 Effect of dictamnine on glutathione S-transferase(GST)activity in HepG2 cells

2.6 白鲜碱对HepG2细胞GGT活性的影响

由表4可见，与1%乙醇溶剂对照组相比，阳性对照PPH和白鲜碱与HepG2细胞分别作用4和24 h，GGT活性均无明显变化。与HepG2细胞作用48 h，与溶剂对照组相比，PPH和白鲜碱200 μmol·L－1组GGT活性明显升高(P＜0.05)。

Tab.4 Effect of dictamnine on glutamyl transferase(GGT)activity in HepG2 cells

2.7 白鲜碱对HepG2细胞线粒体膜电位的影响

由图3和表5所示，白鲜碱与HepG2细胞作用24 h，罗丹明123的荧光强度随着白鲜碱浓度的增加而逐渐下降，呈一定的浓度依赖关系(r=0.978，P＜0.05)，表明白鲜碱浓度越大，线粒体膜电位下降越多，线粒体膜损伤越严重。

Fig.3 Effect of dictamnine on mitochondrial membrane potential in HepG2 cells determined with rhodamine 123(OI:×40;NA=1.25).See Tab.1 for the cell treatment.OI:oil immersion;NA:numerical aperture.A:normal control;B:1%ethanolo;C:carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone(CCCP)20 μmol·L－1for 30 min;D－G:dictamnine 25，50，100 and 200 μmol·L－1for 24 h.

Tab.5 Effect of dictamnine on mitochondrial membrane potential(ΔΨ)in HepG2 cells

3 讨论

近年含有白鲜皮的中药复方如青黛丸、消银片、克银丸、白癜风胶囊、湿毒清胶囊和痔血胶囊等均有造成不同程度肝损伤的报道，引起各方面的关注。本研究观察白鲜皮的主要成分之一白鲜碱的肝细胞毒性。MTT结果表明，白鲜碱对HepG2细胞作用24 h，IC50值为(283±27)μmol·L－1，此结果与Schempp等[2]报道白鲜碱对人Jurkat细胞光毒性作用的 IC50为 245 μmol·L－1相近;但郭娜等[3]报道，白鲜碱对人脾细胞毒性作用的IC50≥1024 mg·L－1(约5.14 mmol·L－1);由此表明白鲜碱对不同类型细胞的毒性不同。LDH是反映外源性化合物引起细胞膜损伤的指标。本研究结果表明，白鲜碱在12.5～50 μmol·L－1时使 HepG2 细胞 LDH 释放率增加，高于50 μmol·L－1时细胞的LDH释放率与溶剂对照组相比无明显差异，这可能与细胞形态皱缩和数目减少有关。显微镜下观察细胞形态的改变也发现，随着白鲜碱浓度的增加，细胞皱缩，脱落，细胞数目迅速减少，漂浮的死亡细胞越来越多。

MTT实验检测的是线粒体内琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase，SDH)的活性，SDH 是线粒体内膜的结合酶，为反映线粒体活性的一种标志酶。白鲜碱对HepG2细胞存活的影响呈浓度依赖关系，提示HepG2细胞线粒体活性随白鲜碱浓度的增大而降低，这与本研究检测的线粒体膜电位随白鲜碱浓度的增大而下降趋势是一致的。肝是体内含酶最丰富的器官，也是酶代谢的主要场所，当肝受损伤时，肝细胞膜通透性增加，肝细胞内的酶外漏，导致血清中酶的活性增高。ALT存在于细胞质，AST主要存在于线粒体。已有研究表明，AD对HepG2细胞的毒性与其引起ALT和AST活性变化有关[8－9]。因此本研究选用AD作为检测HepG2细胞培养液中ALT和AST活性的阳性对照。本研究结果表明，白鲜碱较高浓度(100 和 200 μmol·L－1)能引起HepG2细胞培养液中的ALT活性升高，而白鲜碱低浓度25 μmol·L－1即导致 AST 活性升高，并呈浓度依赖关系，且AST活性升高幅度比ALT更明显。此结果表明，白鲜碱可引起线粒体中的AST外泄，伴随细胞质中的ALT漏出。

HepG2细胞的特点为主要表达Ⅱ相代谢酶，GST是体内生物转化重要的Ⅱ相代谢酶之一。GST亦称为胆红素结合蛋白，由于其分子质量较ALT小，易穿过受损的细胞膜溢出胞外，在肝细胞膜受损时其升高先于ALT的升高，反映细胞毒性更加敏感。GGT在肝中主要在肝细胞线粒体产生，而且对肝毒性的特异性高。因此，本研究深入探讨白鲜碱对 HepG2细胞 GST和 GGT活性的影响。Gerets等[10]报道，一定剂量的Triton X 100能引起HepG2细胞中α-GST活性升高。也有研究报道，一定浓度的AD作用于细胞后，肝细胞受到较严重损伤时，GGT活性特异性地升高[11]。本研究中不同浓度的白鲜碱分别作用4和24 h，较高浓度白鲜碱100 和200 μmol·L－1可使 HepG2 细胞培养液中的GST活性升高。作用时间延长至48 h，可使细胞培养液中GGT活性升高。该结果提示，白鲜碱在达到一定浓度和时间后，可造成HepG2细胞中GST和GGT的释放，GST活性的敏感性更高，作用短时间即受到影响。

综上所述，白鲜碱对HepG2细胞具有毒性，白鲜碱的毒性作用涉及线粒体活性的变化和细胞膜损伤，伴随多种酶活性的改变。

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