姜黄素对气道重塑哮喘大鼠尾加压素Ⅱ的影响

杨能力，梁亚峰，吕 雅，李前君，王均炉

（温州医科大学1.附属第一医院麻醉科，2.附属第二医院 育英儿童医院儿童重症监护室，浙江 温州 325000）

哮喘是严重危害人类健康最常见的疾病之一，其患病率一直呈逐年递增的趋势［1］。气道重塑在哮喘发病过程中发挥重要作用，但迄今为止，尚未找到一种有效抑制哮喘气道重塑的药物。姜黄素（curcu min）在减轻气道炎症和抗纤维化方面具有显著的作用［2－3］，但其在抑制哮喘大鼠气道重塑的作用及其机制尚未完全阐明。尾加压素Ⅱ（urotensinⅡ，UⅡ）是一类重要的内源性血管活性物质，还具有收缩气管平滑肌和促进气道平滑肌细胞增殖作用，在哮喘的病理生理过程中发挥重要作用［4］。我们的前期研究表明，UⅡ在哮喘发病中呈现时间依赖性高表达［5］。本研究通过观察姜黄素对哮喘大鼠的支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）、血清中UⅡ 及肺组织UⅡmRNA表达的影响，探讨姜黄素抑制哮喘大鼠气道重塑的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

姜黄素，卵清蛋白（ovalbu min，OVA），美国Sigma公司，生产批号：076 K7045。大鼠UⅡ酶联免疫检测试剂盒，美国R＆D公司。引物合成由上海生物工程技术有限公司提供。N038型PARI BOY超声雾化器，德国百瑞有限责任公司；Oly mpus光学显微镜，日本光学仪器有限公司；Leica图像采集系统及Leica石蜡切片机，德国徕卡仪器有限公司；Syner gy2酶联检测仪，美国Bio Tek公司。

1.2 大鼠哮喘模型的制备和分组处理［6］

清洁级雄性SD大鼠40只，体质量100～120 g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司〔许可证编号SCXK（沪）2008－003〕。将大鼠按照随机数字表法随机分成5组，每组8只：正常对照组、哮喘模型组和姜黄素50，100和200 mg·kg－1治疗组。以进行处理的当天为第1天，除正常对照组外，哮喘模型组及姜黄素组在第1天和第8天ip给予1.5 ml OVA／Al（OH）3混合液〔内 含 OVA 1 mg 和Al（OH）3100 mg〕，第15天开始雾化吸入1%OVA激发，隔天1次，每次30 min，正常对照组对应ip给予生理盐水和雾化吸入。使用0.5%羧甲基纤维素钠液配制姜黄素混悬液。姜黄素各组从第15天开始，每次激发前30 min分别ig给予姜黄素50，100和200 mg·kg－1，持续6周，正常对照组和哮喘模型组ig对应给予0.5%羧甲纤维素钠液。

1.3 动物标本的收集

末次雾化吸入12 h内，腹腔给予10%水合氯醛（400 mg·kg－1）麻醉，股动脉取血，全血离心（4℃，1000×g，离 心 15 min），吸取血清分装，置于－70℃保存备用。开胸，迅速分离肺组织，结扎右主支气管，经气管行左肺灌洗。10 ml生理盐水分3次灌洗，约30 s后回收BALF，回收率高于80%，灌洗液处理方法同血清。切取右肺肺门上段肺组织，浸入4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋及切片（厚约5μm），HE染色观察。

1.4 支气管管壁厚度和平滑肌厚度测量

每只大鼠选择3支直径1000～1500μm支气管，用彩色医学图像分析技术测定支气管基底膜周径、支气管总面积、管腔面积、平滑肌外缘内气管面积和平滑肌内缘内气管面积。支气管壁厚度＝（支气管总面积－管腔面积）／支气管基底膜周径；平滑肌厚度＝（平滑肌外缘内气管面积－平滑肌内缘内气管面积）／支气管基底膜周径。

1.5 BALF、血清中UⅡ含量及肺组织UⅡmRNA的检测

采用酶联免疫法检测大鼠BALF及血清中UⅡ含量，所有标本按照试剂盒说明书操作步骤进行。使用酶标仪在450 n m处测量吸光度（absor bance，A）。采用逆转录聚合酶链反应（reverse transcription－poly merase chain reaction，RT－PCR）半定量检测肺组织UⅡmRNA的表达。剪去冻存肺组织100 mg，按照 RNAiso Pl us试剂说明书操作，提取RNA，逆转录成c DNA，然后进行扩增，以GAPDH作为内参。UⅡ上游引物：5′－TGCTGAGTACGTGGAGAT－3′；下游引物：5′－GTCTTCTGAGTGGCAGTG－3′，产物长度288 bp；GAPDH 上游引物：5′－ACGGACACTGGTGAAATG－3′；下游引物：5′－GAGTCTCGGCACTGGGAT－3′，产物长度136 bp。取2μl扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶成像分析系统对扩增产物进行扫描，分析测定每一个目的基因及GAPDH的A450nm值，以其A450nm比值表示基因相对表达量。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 姜黄素对哮喘大鼠支气管壁厚度及平滑肌厚度的影响

图1 HE染色结果及定量结果（表1）显示，与正常对照组相比（图1 A），哮喘模型组支气管壁厚度及平滑肌厚度均明显升高（图1 B）（P＜0.01）；经姜黄素干预后，支气管壁厚度及平滑肌厚度均明显低于哮喘模型组（图1C，D，E）（P＜0.01），但与正常对照组相比仍有升高，差异存在统计学意义（P＜0.01）。说明姜黄素干预后，可以减缓支气管壁的增加及平滑肌厚度的增加，但不能完全逆转其发生。

Fig.1 Effect of curcu min on bronchial wall thickness and smooth muscle thickness in lung tissue of asthmatic rats（HE×200）.The rats in ast h ma model gr oup and curcu min gr oup were sensitized with intraperitoneal injection of 1 mg OVA with 100 mg alu minu m hydr oxide dissolved in 1.5 ml saline on day 1 and day 8.They were then challenged with 1%OVA aerosol every other day f or 30 min fr o m day 15 for 6 weeks.Curcu min 50，100 and 200 mg·kg－1 was ig given 30 min bef ore challenge fr o m day 15 f or 6 weeks，respectively.A：nor mal contr ol group；B：ast h ma model gr oup；C，D，E：model＋curcu min 50，100 and 200 mg·kg－1 gr oups，respectively.Arrows show t hickened br onchial s moot h muscle and bronchial wall.

Tab.1 Effect of curcumin on bronchial wall thickness and smooth muscle thickness in lung tissue of asthmatic rats

2.2 姜黄素对哮喘大鼠BALF及血清中UⅡ蛋白含量的影响

表2结果显示，与正常对照组相比，哮喘模型组BALF和血清中UⅡ含量均明显升高（P＜0.01）；不同剂量姜黄素组UⅡ含量与哮喘模型组相比均明显降低（P＜0.01），而与正常对照组相比仍有升高，差异存在统计学意义（P＜0.01）。

Tab.2 Effect of curcumin on UⅡprotein expression in bronchoalveolar lavage fluid（BALF）and ser um

2.3 姜黄素对哮喘大鼠肺组织中UⅡmRNA的影响

表3与图2结果显示，与正常对照组比较，哮喘模型组UⅡmRNA含量明显增加（P＜0.01）；姜黄素干预后，UⅡmRNA含量较哮喘模型组明显减少（P＜0.01）。各组大鼠肺组织中UⅡmRNA的含量与姜黄素剂量存在负相关（r＝－0.817，P＜0.01）。

Tab.3 Effect of curcumin on UⅡmRNA expression in lung tissue of asth matic rats

Fig.2 Effect of curcumin on UⅡmRNA expression in lung tissue of rats by RT－PCR.See Fig.1 f or the legend.Lane 1：normal contr ol group；lane 2：ast h ma model group；lanes 3－5：model＋curcu min 50，100 and 200 mg·kg－1 groups，respectively.

3 讨论

研究发现，哮喘患者肺组织中UⅡ表达明显高于对照组，UⅡ可能通过促进支气管平滑肌收缩作用参与哮喘的发病［7］。人UⅡ在气道中具有收缩活性［8］，同时UⅡ作为气道平滑肌细胞的强丝裂原［9］，呈浓度依赖性地诱导气道平滑肌细胞增殖，其在哮喘患者血浆浓度长时间维持在较高的水平，与哮喘患者气道重塑密切相关。

本研究结果显示，姜黄素不同剂量组大鼠的BALF和血清中UⅡ含量及肺组织UⅡmRNA的表达均明显低于哮喘组，且其降低UⅡ含量及表达的程度具有一定的量效关系。组织病理观察显示，哮喘组大鼠支气管壁厚度及平滑肌厚度增加明显，低剂量姜黄素即引起哮喘大鼠支气管壁厚度及平滑肌厚度降低，且其降低程度与姜黄素浓度呈现一定的量效关系，与大鼠BALF和血清中UⅡ含量及肺组织UⅡmRNA各剂量组变化基本一致。说明姜黄素抑制哮喘大鼠气道重塑的作用与调控UⅡ的表达变化有关。因此，对姜黄素的进一步研究有助于了解其在哮喘大鼠气道重塑方面的作用及机制。

还有研究显示，姜黄素对哮喘的防治作用尚与其抗炎效应有关。姜黄素能抑制大鼠多形核中性粒细胞白三烯的形成，减轻炎性细胞前炎症因子等作用［10］。当然，姜黄素对哮喘气道重塑的的抑制作用及机制复杂，还有待进一步研究。

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