辅以抗生素的牙周机械治疗对伴动脉粥样硬化牙周炎大鼠的颈动脉及血清超敏C—反应蛋白的影响

任秀云 常乐 岳姿洁 林牧 石学雪 孙丽莉

[摘要] 目的 研究伴动脉粥样硬化（As）的慢性牙周炎（CP）大鼠模型中血清超敏C反应蛋白（hsCRP）的表达及颈动脉血管的病理变化，探讨牙周基础治疗辅以抗生素对As的影响。方法 35只SD大鼠随机分为两大组：A组（正常对照）和B组（CP+As），建立CP+AS模型后再将B组分为4组，自然进程组（B1）、牙周机械治疗组（B2）、机械治疗+局部药物组（B3）、机械治疗+局部药物+抗生素组（B4），每组7只，接受相应的牙周干预治疗。通过酶联免疫吸附（ELISA）法检测血清中hsCRP的质量浓度，光镜下观察颈动脉血管组织的病理变化。结果 随着时间推移，B1组hsCRP质量浓度逐渐升高，在第2次干预后5周（第5次取样时间点）明显高于其他组（P<0.001）；B2、B3、B4组hsCRP先逐渐升高，在第2次干预后1周（第3次取样时间点）达到高峰，之后逐渐下降，低于其基线水平，但仍高于A组（P<0.05）。第2次干预后3周（第4次取样时间点）起，B3、B4组hsCRP显著低于B2组（P<0.001）。病理结果：B1组可见炎症细胞浸润及大量泡沫细胞，弹性纤维明显紊乱破坏；B2组血管壁厚薄不均，可见泡沫细胞，弹性纤维紊乱；B3组血管壁轻度增厚，弹性纤维排列较整齐；B4组血管壁厚度较均匀，弹性纤维排列整齐。结论 对于伴有As+CP的大鼠，牙周基础治疗短期内可能会增加As的发展风险，而从长期作用来看可能会改善As病变；在牙周机械治疗的基础上增加局部抗炎、全身抗生素治疗可优化其疗效。

[关键词] 牙周炎； 动脉粥样硬化； 牙周机械治疗； 超敏C-反应蛋白

[中图分类号] R 739.86 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.05.015

目前的研究[1]认为，牙周炎与动脉粥样硬化（atherosclerosis，As）及其危险因素之间存在复杂而广泛的联系。C-反应蛋白（C-reactive protein，CRP）是一种由肝脏产生的，仅在感染或非感染来源的炎症性疾病中表达的急性期反应蛋白[2]。CRP在牙周炎患者血清中表达升高，同时也是As患者血清炎症反应的灵敏标志物[3]。研究发现，超敏CRP（high-sensitivity CRP，hsCRP）≥3.0 mg·L-1者罹患包括心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）在内的慢性感染性疾病的危险性增加，被认为是CVD的危险因素之一[3]；而牙周治疗可在短期内引起CRP升高，长期则出现下降的趋势[4-5]。本研究通过建立慢性牙周炎（chronic periodontitis，CP）合并As的SD大鼠模型，在本课题组前期研究[6-8]的基础上，加大样本量，在牙周机械治疗的基础上增加局部抗炎及全身抗生素治疗，采用酶联免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法动态检测血清中的hsCRP水平，同时在光镜下观察大鼠颈动脉的形态学变化，探讨牙周基础治疗辅以抗生素对As病变的影响，为临床医师治疗伴有As的牙周病患者时选择安全合理的治疗方案提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 选择清洁级6周龄雄性SD大鼠35只进行实验。大鼠体重180～200 g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，合格证号：SCXK（京）2009—0004。

1.1.2 主要实验材料与试剂 维生素D3注射液（上海通用药业股份有限公司，批号：111111），阿莫西林胶囊（哈药集团制药总厂，批号：A111200318），甲硝唑片（亚宝药业集团股份有限公司，批号：120105），盐酸米诺环素软膏（盛势达国际贸易上海有限公司，批号：1111181）。大鼠血清hsCRP的ELISA试剂盒（上海蓝基生物科技有限公司，hsCRP最低检测质量浓度为1.0 ng·mL-1）。

1.1.3 实验用牙周致病菌 牙龈卟啉单胞菌标准菌株ATCC33277，由首都医科大学口腔微生物研究室提供。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株培养 将牙龈卟啉单胞菌标准菌株置于CDC厌氧血琼脂平板上培养，在85%N2、10%CO2和5%H2条件下培养3～5 d，再接种于CDC液体培养基中培养2～3 d，以达到最佳的菌细胞密度（约为1×108 CFU·mL-1）。接种前将菌液用培养液稀释至1×106 CFU·mL-1以备用。

1.2.2 分组及建模 将35只SD大鼠适应性喂养2周后，随机分为2个大组：正常对照组（A组，7只），采用正常饲料喂养；CP+As组（B组，28只），建立CP+As模型。建模方法：大鼠采用5%的水合氯醛腹腔注射麻醉，取仰卧位，固定四肢和头部，以上颌第一、二磨牙（M1、M2）作为实验牙，用3—0丝线缠绕于正畸结扎丝（直径0.20 mm）上，将其8字结扎于实验牙的牙颈部（尽量置于龈沟内），而后将牙龈卟啉单胞菌的菌悬液接种于龈沟内，每3天接种1次[9]。一次性腹腔注射维生素D3 7×105 IU·kg-1，2周内逐渐增加高脂饲料[质量分数分别为1.5%胆固醇+0.2%猪胆盐+5%猪油（自制）+93.3%基础饲料]直至完全替代普通饲料[10-11]。

B组根据模拟的临床牙周干预治疗再分为4小组，每组7只：自然进程（B1）组、牙周机械治疗（B2）组、机械治疗+局部药物（B3）组和机械治疗+局部药物+抗生素（B4）组。

术后15周（从开始建模起），随机检查1只B1组大鼠，若发现左右上颌第一、二磨牙松动明显且有深牙周袋，则处死该鼠进行血管病理切片检查，若发现有脂质沉积形成，认为CP+As建模成功，开始进行牙周干预。

1.2.3 牙周干预 B组牙周干预方法：B1组不给予任何牙周干预措施，任其自然发展；B2组进行牙周机械治疗，包括龈上洁治+龈下刮治+根面平整术，每次治疗1个象限的2颗患牙，共治疗2次；B3组进行牙周机械治疗（同B2组），同时给予局部药物（盐酸米诺环素软膏）治疗，每次治疗1个象限的2颗患牙，共2次；B4组进行牙周机械治疗、局部药物治疗（同B3组），同时给予抗生素全身治疗。抗生素治疗共干预2次，每次干预时采用灌胃法服用阿莫西林（200 mg·kg-1）和甲硝唑（100 mg·kg-1），每天1次，连续治疗3 d。

1.2.4 牙周检查 大鼠适应性喂养2周后开始进行牙周检查，检查每颗实验牙的牙周袋深度（probing depth，PD）、龈沟出血指数（sulcus bleeding index，SBI）以及牙齿松动度（tooth mobility，TM）等。检查时使用Williams牙周探针，由同一人每2周检查1次。

1.2.5 血清hsCRP检测 建模成功后，分别采集5次血清：干预前1周、第1次干预后1周、第2次干预后1周、第2次干预后3周、第2次干预后5周。采血前各组动物禁食12 h，尾静脉采血1.5 mL。采用ELISA法检测各组大鼠血清中hsCRP水平，严格按说明书操作。

1.2.6 动物处死、取材及处理 第5次采血完成后1周，全部动物进行安乐死。解剖大鼠，分离截取双侧颈总动脉及分叉段标本（长约1 cm），剥离颈动脉筋膜，无菌生理盐水冲洗，用10%中性甲醛溶液固定48 h，常规石蜡包埋后，以5 μm的厚度行血管横断面切片，苏木精-伊红（hematine-eosin，HE）染色，显微镜下观察各组大鼠颈总动脉血管壁的形态学变化。

1.3 统计学分析

采用SPSS 13.0统计软件对数据进行统计学处理，组间比较采用重复测量资料的方差分析，两时间点比较采用Bonferroni法检验，检验水准为双侧α=0.05。

2 结果

2.1 牙周检查情况

建模前，各组大鼠实验牙牙龈色粉质韧，无炎症变化。建模成功后，A组上颌M1、M2未见炎症改变。B组（B1、B2、B3、B4组）实验牙均出现典型慢性牙周炎症状，牙颈部8字结扎处可见软垢、食物残渣，个别严重者可见牙石，牙龈红肿，探诊出血明显，SBI=3，可探及1.5～2 mm的牙周袋，有牙龈退缩以及附着丧失，松动度达Ⅱ°。

2次牙周干预后5周， B1组牙龈红肿明显，牙龈退缩严重，SBI=4，有1.5～2 mm的牙周袋，松动度达Ⅱ°～Ⅲ°；B2组牙龈色粉质韧，牙龈退缩有所改善，SBI为1～2，可探及1～1.5 mm的浅牙周袋，松动度Ⅰ°；B3、B4组牙龈色粉质韧，牙龈退缩明显改善，SBI=1，可探及0.5～1 mm的浅牙周袋，牙松动不明显。

2.2 大鼠颈总动脉血管壁病理学改变

A组颈总动脉血管壁的厚度均一，内膜完整，中膜平滑肌细胞（smooth muscle cell，SMC）和弹性纤维排列整齐，未见泡沫细胞（图1A）；B1组血管壁明显增厚，可见SMC迁移至内膜并有炎症细胞黏附，中膜SMC变性萎缩，形成大量泡沫细胞，弹性纤维明显紊乱破坏（图1B）；B2组血管壁厚薄不均，内膜炎症细胞黏附，中膜SMC变性萎缩，可见泡沫细胞广泛分布，弹性纤维紊乱（图1C）；B3组血管壁轻度增厚，可见炎症细胞黏附于内膜，中膜SMC空泡变性，弹性纤维排列较整齐（图1D）；B4组血管壁厚度较均匀，内膜可见炎症细胞黏附，SMC变性，可见泡沫细胞形成，但弹性纤维排列整齐（图1E）。

2.3 hsCRP表达水平

各组牙周干预前后hsCRP的变化见表1。在所有的取样时间点，与A组相比，B组（除B3、B4组第5次取样时间点外）hsCRP质量浓度均明显升高（P<

0.001）。B1组hsCRP质量浓度随着时间的变化逐渐升高，尤其是第5次取样时明显高于其他组（P<

0.001）；B2、B3、B4组hsCRP随时间变化逐渐升高，在第2次干预后1周达到高峰，此后逐渐下降，低于其基线水平，但仍高于A组（P<0.05）。第2次干预后3周及5周，B3、B4组hsCRP质量浓度明显低于B2组，其差异有统计学意义（P<0.001）。

3 讨论

大量临床流行病学和干预研究表明，牙周治疗在短期内可引起As一些中间替代指标（CRP、白细胞介素-6、内膜和中膜厚度）升高，而长期则会使这些指标下降[4-5，12-13]，进而推测牙周治疗可能会降低As发生的风险。Meta分析结果表明，对首次诊断为心肌梗死和出血性脑卒中的患者进行侵入性口腔治疗，治疗后的前4周内血管事件的发生率会显著升高，而其后的6个月则会降低并逐渐达到基线水平[14]。但是，这些临床干预研究由于伦理学原因，只有中间替代指标的结果，缺乏终极结局指标血管的病理学支持。

目前相关的动物实验研究[10-11]多数都是在建模成功后就立即处死动物，缺乏建模后各种口腔干预措施对As影响的研究。由于牙周病的主要治疗多属于有创治疗且确实对各型牙周炎的控制都有很好的疗效，那么这种口腔干预措施（有创治疗）对As的发生发展有何影响？是改善还是加重？本课题组前期通过动物实验[7-8]研究牙周干预的效果，结果表明，在高脂状态下，直接的牙周机械治疗后，在短期内（第2次干预后1周左右）hsCRP的量急剧增加，且血管出现明显的As病变，有纤维帽形成和斑块破裂，提示直接进行牙周机械治疗可能会加重As的病变且hsCRP可能参与了As加重的病变过程。这种改变仅仅是牙周机械治疗后引起的短期改变还是永久改变？随着时间的延长，血清中炎症因子hsCRP的含量会否降低？血管的病理改变是否也会随之改善？单纯进行牙周机械治疗可以引起明显的血管病理改变，那么怎样的治疗方案才是合理安全的？局部及全身辅助用药是否会改善炎症状态和血管的病理改变？为了解决这些问题，本研究在前期研究的基础上，增加了大鼠的数量（每组7只均成活）并延长了4周的观察期（从首次口腔干预开始到最后处死共观察9周），增加了2次血清采样时间的标本，并且在牙周机械处理的措施中，增加了局部和全身用药。

本次研究结果显示：2次牙周干预治疗后，B组（CP+As）的hsCRP质量浓度较正常对照组明显升高，其中B1组随着时间延长呈现持续升高，在最后1次采血时（第2次干预后5周左右）hsCRP含量明显高于其他各组，同时病理切片显示血管壁明显增厚，可见SMC迁移至内膜并有炎症细胞黏附，中膜SMC变性萎缩，形成大量泡沫细胞，弹性纤维明显紊乱破坏，提示牙周局部炎症持续存在可能会加重As的病变程度。

CP+As组的其他各干预组随时间改变hsCRP质量浓度逐渐升高，在第2次干预后1周达到高峰，该结果与本课题组的前期研究结果[7-8]保持了部分一致，即在短期内牙周干预措施可能引起全身水平的急性期反应，促使hsCRP水平迅速升高，但是随着观察时间进一步延长，hsCRP含量逐渐下降。这与Tonetti等[4]的临床干预研究结果极为相似。

本研究对牙周基础治疗措施进行了更细致的划分，除机械治疗（洁治+刮治+根面平整）外，还增加了局部抗炎药物和全身抗生素治疗。局部抗炎药使用的是临床牙周病治疗中的常用的局部药物——盐酸米诺环素软膏（派丽奥），全身用药主要是阿莫西林和甲硝唑，结果表明：在牙周局部机械治疗的基础上，辅助局部和全身用药可以明显降低血清hsCRP质量浓度，且颈动脉血管的病理变化也较单纯机械治疗组及自然进程组减轻。

在CP+As建模成功后，对各组进行常规牙周检查发现，B1～B4组均有1.5～2 mm的深牙周袋，符合派丽奥软膏使用适应证。B3和B4组在2次牙周干预时，在牙周机械治疗基础上将该药均匀注射至深牙周袋内直至溢出龈缘，且术后2 h内禁食禁水以更好地维持药效。第2次牙周干预后5周，B3、B4组的PD、SBI和牙齿松动度均有明显改善。从血清学结果看，与其他干预组相比，机械治疗+局部药物+抗生素组（B4组）在最后1次取样时hsCRP质量浓度最低，牙周局部炎症反应改善最为明显，且颈动脉病变最轻。单纯机械治疗组比其他辅助用药的两组hsCRP表达高，同时病理结果也显示颈动脉有较明显的As病理改变。该结果表明，局部抗炎、全身抗生素治疗可以优化单纯牙周机械治疗的效果，尤其是二者同时使用时疗效最显著，这提示，临床上对于伴有As的牙周病患者，在单纯牙周基础治疗的同时增加局部抗炎和全身抗生素应用，可能会更加有效地降低As的病变及风险，值得临床借鉴。

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（本文编辑 吴爱华）