高脂饮食脂肪肝胰岛素抵抗大鼠中PPARα的表达对肝组织的影响

王素格 李德征 蒋树林 秦明月

近年来人们生活水平日益提高，而日常膳食中以脂肪为代表的高热量食物成分所占比例明显增加，使非酒精性脂肪肝炎(non alcoholic steatohepatitis，NASH)的发病率日益增长［1］，从而成为人们普遍关注的问题。有大量研究发现，胰岛素抵抗(IR)是NASH发病的首要环节［2－4］，而过氧化物酶体增殖物激活 受 体 α(peroxisomeproliferator-activated receptoralpha，PPARα)是调节胰岛素敏感性的一个重要因子，并且它的激动剂可能减少肝脏的脂质沉积，从而使脂肪性肝炎得到改善，因此我们通过高脂饮食诱导脂肪肝胰岛素抵抗模型的成立，然后观察IR及PPARα的mRNA在NASH中的表达情况，为NASH的治疗提供新的药物作用靶点。

1 材料与方法

1.1 建立动物模型 雄性SD大鼠60只，体重120～160 g，鼠龄4～6周，分笼饲养在温度22～28℃动物室中，明暗各12 h，自由进食及饮水，适应性饲养1周后，随机分为4组，正常组20只、高脂组20只，实验组10只、实验对照组10只。正常组喂饲普通饲料;高脂组、实验组、实验对照组喂饲高脂饲料［5，6］，其配方:普通饲料加1%胆固醇和10%蛋黄粉、10%猪油，－20℃冰箱保存，喂前平衡室温。12周末时正常组与高脂组各取10只一并进行钳夹及肝组织石蜡切片HE染色，确定胰岛素抵抗脂肪肝动物模型造模成功;实验组在高脂饮食同时给予非诺贝特80 mg·kg－1·d－1灌胃;实验对照组将高脂饮食改为正常饮食;实验组每天定时给药，其余各组均给予等体积的0.9%氯化钠溶液灌胃，持续4周后所有大鼠分别测定胰岛素敏感性，然后处死大鼠留取所需标本。

1.2 主要试剂 胆固醇购自南京新百药业有限公司，猪油由河北医科大学实验动物中心提供，非诺贝特(力平之)200 mg为法国利博福尼公司产品，丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、三酰甘油(TG)、胆固醇(TC)采用德国Bbyer公司的全自动血清生化分析仪检测，由河北医科大学第二医院生化室协助。RNA提取试剂盒及GAPDH均为北京赛百盛基因技术有限公司产品。

1.3 观察指标及测定方法

1.3.1 一般情况:每天观察动物的毛色、活动及粪便与进食水情况，每周测定大鼠体重。

1.3.2 空腹血清TC、TG、ALT、AST及血糖测定:用全自动生物化学分析仪测定，全部应用酶法完成。

1.3.3 病理学检查:中性甲醛固定肝标本，石蜡包埋，常规切片行HE染色，光镜下观察肝脏脂肪变性及炎症的程度。由富有经验的病理医生在不知分组情况下作出诊断。对肝脂肪变性和炎性细胞浸润程度分级、评分判断标准参照文献［7－9］。

1.3.4 IR的测定:用正常血糖高胰岛素钳夹技术［10］，求取60～120 min的13个GIR的平均值，该指标反应大鼠的胰岛素敏感性，GIR越小，机体的IR越严重。

1.3.5 PPARα的mRNA表达水平的测定:钳夹结束后迅速取出肝脏组织，冰上取肝脏同一部位切取1块肝组织约100～150 mg，将组织放入高压处理的EP管中，编号记录后迅速液氮冷冻保存，采用RT－PCR法检测PPARαmRNA的表达。根据参考文献选取引物并合成，PPARα(Gen Bank网站)上游引物:5′－CCTGGAAAGTCCCTTATCT－3′，下 游 引 物:5′－GCCCTTGCAGCCTTCACAT－3′，319 bp，GAPDH 上游引物:5′－TCCCTCAAGATTGTCAGCAA－3′，下游引物:5′－AGATCCACAACGGATACATT－3′，308 bp。

①RNA提取:用Trizol一步法提取总RNA，按说明书进行。②逆转录:用20 μl体系逆转录RNA ，取总RNA 2 μl，随机引物(dN)9 1 μl，DEPC 处理水 7 μl，5 × MMLV buffer 4 μl，dNTP 2 μl Rnasin 10 U/μl，MMLV RTase 1 μl，100 m MDTT 2 μl，70℃5 min，37℃ 1 h 94℃ 5 min。③PCR 反应体系 20 μl:取2 μl逆转录产物进行 PCR，10 × Taq 缓冲液2 μl，PCR 染料2 μl，Taq DNA聚合酶 0.2 μl，0.1 mmol/L，dNTP，上下游引物各20 pmol。PCR扩增反应条件为:预变性 94℃、5 min、1 min;变性 94、30 s，退火(PPARα 56℃;GAPDH 56℃)40 s，延伸 72℃、45 s，循环数(PPARα 35次;GAPDH 30次)，终末延伸 72℃、10 min。模板量及循环次数经检测均在线性范围内。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳后，以UVP计算机图像扫描分析系统Robocycler 4.0测定电泳条带密度值，以GAPDH为内参照，Excel计算PPARα基因mRNA的相对含量，结果以PPARα条带占GAPDH条带密度的百分率表示。

1.4统计学分析应用SPSS 14.0统计软件，计量资料以±s表示，采用t检验、秩和检验、方差分析和直线相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 4组大鼠均生长良好，至实验结束时无1例死亡。正常对照组大鼠精神充沛，灵活好动，皮毛整洁，而高脂组性情温顺，喜卧懒动，皮毛凌乱，光泽度差。实验前各组体重差异无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。12周末时，高脂组及各给药组与正常组比较，体重均明显增加(P＜0.05)。实验结束时，实验组及实验对照组与高脂组比较，体重减轻(P＜0.05)，而高脂组体重比正常组显著增高(P＜0.01)。见表1。

表1大鼠体重的变化n=10，g，±s

表1大鼠体重的变化n=10，g，±s

注:与正常组比较，*P ＜0.05;与高脂组比较，#P ＜0.05

组别 0周 12周 16周167±16 365±25 408±39高脂组 170±14 440±21* 496±20实验组 178±9 457±39* 428±43*#实验对照组 181±9 440±41* 460±25*#正常组

2.2 血清ALT、AST、TC及TG的变化 实验结束时，高脂组ALT、AST较正常组显著增高(P＜0.01);与实验组及实验对照组比较，AST明显降低(P＜0.01)，而ALT仍高于正常范围，差异无统计学意义(P ＞0.05)，但有下降趋势，TC、TG明显降低(P ＜0.01)。见表2。

表2大鼠血清生化学指标的变化n=10，±s

表2大鼠血清生化学指标的变化n=10，±s

注:与正常组比较，*P ＜0.05;与高脂组比较，#P ＜0.05

组别 TC(mmol/L) TG(mmol/L) ALT(U/L) AST(U/L)1.14±0.13 0.24±0.05 42±7 92±21高脂组 2.18±0.25* 0.46±0.08* 56±12* 127±30*实验组 1.47±0.37*# 0.23±0.05# 50±9 102±14#实验对照组 1.66±1.98*# 0.34±0.07*# 52±8 117±23正常组#

2.3 肝脏病理学观察 正常组大鼠肝脏无异常变化。高脂组肝脏体积明显增大，包膜紧张，边缘变钝，颜色呈土黄色，甚至可见局灶性黄白色变性灶，与周围组织有粘连，切面油腻。实验组及实验对照组部分肝脏颜色接近正常，表面呈浅黄色，油腻减轻。

光镜下，正常组大鼠肝脏组织HE染色未见明显异常(图1 A);高脂组肝细胞均呈弥漫性脂肪变性，肝细胞脂肪变性面积达到2/3以上，肝细胞界限不清，肝窦狭窄，部分肝组织在脂肪变的基础上伴有小叶内炎症，大部分出现汇管区炎症，小叶内有灶性坏死，坏死灶周围有大量炎细胞浸润，无肝纤维化(图1 B);实验组及实验对照组脂肪变程度较高脂组明显减轻，未见明显肝细胞坏死(图1 C、D);进一步脂肪变及炎症程度评分统计结果示:高脂组10例中脂变程度2级4例，3级6例，10例均为脂肪性肝炎;而实验组及实验对照组脂肪变及炎症程度均明显减轻，与正常组比较差异有统计学意义(P＜0．01)，实验组与实验对照组间差异无统计学意义(P＞0．05)。

图1 4组肝组织光镜表现

2．4 血糖、葡萄糖输注率、PPARαmRNA表达的变化 16周末，正常组空腹血糖与高脂组、实验组及实验对照组比较，差异均无统计学意义(P＞0．05)，但高脂组有增高趋势;GIR 60～120中正常组与高脂组、实验组及实验对照组比较差异有统计学意义(P＜0．05)。高脂组与实验组、实验对照组比较有统计学意义(P ＜0．05)。PPARα mRNA变化规律为:实验组、正常组、实验对照组、高脂组表达量依次降低，高脂组与实验组比较有统计学意义(P＜0．05)。见表3。

表3 4组大鼠血糖、葡萄糖输注率及晖度比值的比较

3 讨论

NASH是以肝细胞脂肪变性、灶性坏死及小叶内炎症为特征的遗传一环境一代谢应激相关的临床病理综合征，有研究表明IR是NAFLD发病的主要环节，它使机体脂质代谢平衡紊乱，导致肝细胞内脂质积聚，然后是氧自由基引起脂质过氧化反应及其以瀑布效应诱发的炎症反应，而PPARs是一种新型甾体类激素受体，也是配体激活转录因子，包括PPARα、PPARβ、PPARγ3种亚型，PPARα主要表达于肝脏、肾脏、心脏和肌肉等进行脂肪酸氧化的组织中，在脂肪肝、胰岛素抵抗的发生发展中有着重要影响。本研究发现FC组大鼠肝组织中PPARα的mRNA比NC组明显降低，IR明显加重，肝脏脂肪变呈中重度改变;许多学者研究发现PPARα激活剂是防治NASH的一种新策略，而目前已经明确PPARα激动剂是贝特类调脂药，对NASH的治疗作用受到广泛关注。本研究结果显示，与FC组相比，FF组与FR组PPARα的mRNA表达均明显增强，从而IR改善，肝脂肪变及炎症坏死明显减轻，血中TG降低，以上结果表明PPARα激动剂可改善IR，使肝脏脂肪变及炎症程度减轻，降低血中TG水平，阻止NASH进展，机制可能是由于PPARα被激活后一方面直接促进肝内脂肪酸的氧化，使合成的脂肪酸和局部脂肪酸水平降低，从而减轻了脂质的沉积，改善胰岛素抵抗;另一方面可直接改善肝脏脂蛋白和脂质代谢的基因，使肝脏FFA的β-氧化增加，减少肝内脂质的沉积。值的一提的是非诺贝特组与改良组在改善脂肪变上无统计学意义(P＞0．05)，说明在药物干预的同时，仍然坚持不良的生活习惯，将难以控制肝脏脂肪变性，而改变不良的饮食习惯，是防治IR的根本。但也有研究表明激活PPARα调节过氧化物酶体、微粒体中参与脂肪酸氧化的酶的表达，其持续活化在脂肪酸氧化增强的同时，也产生大量的H2O2及活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，在单纯性脂肪肝的基础上发生脂质过氧化，促进脂肪性肝炎、脂肪性纤维化的形成和发展［13－14］。

综上所述，PPARα、IR及NASH之间关系错综复杂，深人探讨它们之间的相关性将为NAFLD的发病机制提供有利的证据，并为其有效的防治提供新的思路。

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