658 nm低能量激光照射对人牙周膜细胞生物学效应的影响＊

关为群，杨 宾，王瑜华

(1.福建医科大学附属协和医院，福建福州 350001;2.医学光电科学与技术教育部重点实验室，福建师范大学激光与光电子技术研究所，福建福州 350007)

激光在口腔医学中应用已成为一个新的研究方向。早期有关激光治疗牙周病的研究局限于利用激光的热能效应来杀灭牙周袋中的致病菌甚至改变菌丛的组成变化来达到治疗目的［1］。激光的杀菌作用随着功率的增大而增强，但对靶器官和邻近组织、细胞损伤的可能性也随之增大。低能量激光疗法(lowlevel-laser therapy，LLLT)，是通过低能量激光作用于靶组织使其达到调节机能，促进组织功能恢复的作用。临床应用中低能量激光波长范围大多在600～950 nm间，且输出功率只有毫瓦级别，治疗过程中不会对生物组织产生不可逆损伤。近几年的研究表明:LLLT对多种细胞有增殖效应［2-5］。牙周病治疗的最终目的是通过刺激牙周膜中的前体细胞分化和再生，促进新附着的形成。人牙周膜细胞(human periodontal ligament cells，hPDLCs)作为一组具有多向分化潜能的细胞，其与牙周组织的修复再生密切相关。因此，本研究通过658 nm低能量激光照射体外培养的人牙周膜细胞，观察不同能量密度照射对人牙周膜细胞增殖、碱性磷酸酶活性及纤维连接蛋白合成的影响，旨在为低能量激光应用于牙周治疗提供理伦依据。

1 材料和方法

1.1 主要器材和试剂

658nm 激光器(Newport，USA)，激光功率计(spectral407a)，L-DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(GIBCO，USA)，β-甘油磷酸钠、抗坏血酸、地塞米松(Sigma，USA)，抗人角蛋白抗体广谱，抗人波形丝蛋白抗体(北京中杉)，噻唑蓝 (MTT，Amresco)，二甲基亚砜(DMSO，上海生工)，组织细胞裂解液(北京鼑国生物公司)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京鼑国生物公司)，碱性磷酸酶试剂盒(南京建成科技有限公司)，人纤维连接蛋白ELISA试剂盒(武汉博士德)。

1.2 方法

1.2.1 hPDLCs的培养及来源鉴定 经患者本人或家长同意，取12-19岁因正畸需要拔除的牙周健康前磨牙，采用改良组织块法［6］在6孔板中培养 hPDLCs。每3天换液一次。待组织块周围细胞生长密集时原孔消化后继续培养。细胞汇合后传代培养。免疫细胞化学法对第4代细胞进行波形蛋白抗体、广谱细胞角蛋白染色，PBS液作为空白对照组。取第3代人牙周膜细胞，以 1×105/mL密度接种至35 mm培养皿中，24 h后弃原培养液，用DMEM矿化诱导液(其中含 10%FBS，10 mmol/L β-甘油磷酸钠，50μg/mL抗坏血酸，10 mol/L地塞米松)连续培养5周，镜下见矿化结节形成后，0.1%茜素红染色，镜下观察染色情况。

1.2.2 细胞接种密度的选择 取第五代对数期生长的hPDLCs，制备十种不同浓度的细胞悬液 (1.0×104个/mL，2.0×104个/mL，至 10 ×104个/mL)，每个细胞浓度对应一个组，共分十组，依次加入96孔板中培养。每孔接种200μL，每组设6个复孔，共接种3块板。细胞接种后置5%CO2，100%湿度，37℃培养箱培养24 h，48 h，72 h后用MTT法测定细胞的吸光度(OD值)。

1.2.3 激光照射方法及分组 将第5代hPDLCs按2×104个/mL的细胞密度接种于96孔板，共接种9板。每板分空白组，对照组和实验组，空白组为不含细胞的DMEM培养液，其余两组接种细胞。每组重复6孔，每孔接种200μL。为阻挡激光散射对邻近孔内细胞的影响，相邻孔间添加0.4%无菌台盼蓝染液。每块采用658 nm激光器进行照射。激光器输出模式为连续模式，光纤直径为400μm，光纤末端输出功率调节为11 mW，光斑面积为0.34 cm2，实验组照射时间分别为69 s，138 s，对应能量密度分别为1.86 J/cm2和 3.72 J/cm2，对照组不进行激光照射，其余条件同实验组。激光照射通过96孔板板盖照射并在暗室中进行，室温为28℃。

1.2.4 MTT法检测hPDLCs增殖效应 激光照射24 h，48 h，72 h后，分别取出相应孔板，每孔加5 mg/mL MTT 20μL，继续培养4 h后终止培养。小心吸弃培养液，每孔加 DMSO150μL，振荡 10 min，使结晶物充分溶解。在酶标仪490 nm波长处测定各孔细胞吸光度值(OD值)。

1.2.5 激光照射后hPDLCs碱性磷酸酶(ALP)活性测定 分别在激光照射24 h，48 h，72 h后，按照ALP检测试剂盒及BCA蛋白浓度测定试剂盒检测ALP活性及细胞总蛋白量，并计算单位蛋白含量的相对ALP活性。

1.2.6 ELISA法检测激光照射对hPDLCs中合成纤维连接蛋白 FN的影响 激光照射24 h，48 h，72 h后，按照不同组别收集细胞培养液至干净EP管中，室温下，3000 r/min，15 min，收集上清液，按照人纤维连接蛋白试剂盒说明进行测定，用酶标仪在检测波长450 nm下测定细胞培养液中FN含量。

1.2.7 统计学分析 采用SPSS11.5统计学软件进行数据分析，所有数据以表示，组间比较用单因素方差分析，两组间差异用LSD检验，检验水准α =0.05。

2 结果

2.1 细胞培养和鉴定

4～8天内，hPDLCs可从组织块周围游出，镜下观察可见细胞排列呈放射状或漩涡状，多为长梭形或星形，胞体丰满，胞浆均匀，核呈圆形或椭圆形(图1)。细胞波形蛋白染色阳性(图2)，角蛋白染色阴性(图3)，证明细胞来源于中胚层。hPDLCs矿化液诱导5周后，镜下可见颗粒状的不透明结节形成，呈片状或层状，茜素红染色后呈深红色(图4)。

图1 hPDLCs原代培养 ×100Fig.1 Primary culture of hPDLCs ×100

2.2 hPDLCs接种密度生长曲线

根据hPDLCs不同时间段细胞接种浓度同OD值折线图(图 5)，进行线性趋势分析，24 h，48 h，72 h细胞接种浓度在2.0×104/mL与6.0×104/mL之间同细胞OD值呈线性关系，相关系数分别为0.9762、0.9542、0.9621。由于本实验观察周期较长，故选择最低细胞浓度2.0×104/mL作为合适的接种浓度。

图2 波形蛋白呈阳性SABC×100Fig.2 Vimentin postive stain of hPDLCs×100

图3 角蛋白呈阴性SABC×100Fig.3 Keratin negative stain of hPDLCs immunnohistochemical SABC method×100

2.3 658 nm激光照射对hPDLCs增殖效应影响

如表一所示:激光照射24 h后，实验组同对照组相比，OD值显著高于对照组(P＜0.01);照射48 h后，实验组OD值低于对照组，二者比较具有统计学意义(P＜0.01);72 h后，实验OD值高于对照组，具有显著差异(0.05);但不同时间点实验组两者间无统计学意义(P＞0.05)。

图4 矿化结节 茜素红染色 ×100Fig.4 Mineralize nodule of hPDLCs positive Alizarin red staining×100

图5 hPDLCs增殖率同接种浓度及培养时间三者关系折线图Fig.5 The line chart of hPDLCs proliferation rate relations with inoculation concentration and incubation time

表1 658 nm激光照射对hPDLCs增殖效应的影响(OD 值，x±s，n=3)Tab.1 Influence of 658 nm laser irradiation on hPDLCs proliferation effect

2.4 658 nm激光照射hPDLCs对ALP活性影响

658 nm 激光照射 hPDLCs 24 h，48 h，72 h 后，检测细胞培养液中ALP含量以及细胞蛋白含量。根据蛋白标准曲线，得出每孔蛋白含量，计算出单位蛋白含量的相对ALP活性。

如表2所示:在同一培养时间点，激光照射hPDLCss后，细胞分泌ALP含量增高，并且随激光照射能量密度的增加而升高;但激光照射后随着培养时间的延长，细胞分泌ALP含量未见明显变化。

激光照射24 h，48 h，72 h 后，1.86 J/cm2组同相应时间点对照组相比，虽然细胞分泌ALP较对照组高，但二者间无统计学意义;3.72 J/cm2组同相应时间点对照组相比，二者间具有统计学意义，说明3.72 J/cm2能显著促进 hPDLCss分泌 ALP。激光照射24 h，48 h后，不同剂量照射组间无统计学意义，但72 h后，二者相比有统计学意义。

2.5 658 nm激光照射hPDLCs合成FN影响

如表3所示:激光照射hPDLCs 24 h后，培养液中FN含量未见增高，激光照射48 h和72 h后，照射组培养液中FN含量较对照组增高。但激光照射48 h后，同对照组相比无统计学差异(P＞0.05)，仅在激光照射72 h后，实验组比对照组细胞上清液中FN含量高(P＜0.05)，但实验组组间相比无统计学意义(P ＞0.05)。

表2 658 nm激光照射对hPDLCs分泌ALP的影响(OD 值，x± s，n=3)Tab.2 658 nm Laser irradiation effects on ALP hPDLCs secretion

表3 ELISA检测658 nm激光照射对hPDLCs合成 FN 的影响(OD 值，x±s，n=3)Tab.3 658 nm Laser irradiation effects on hPDLCs synthesis of FN by ELISA

3 讨论

MTT法是检测细胞增殖的常见方法之一。本实验中96孔板每孔生长面积有限，细胞接种浓度的多少同实验结果的真实性密切相关。因此，本实验通过接种不同浓度的细胞，计算细胞接种浓度同OD值间的线性关系，确定合适的细胞接种浓度，以排除细胞接种浓度对实验结果的影响。除此之外，激光在不同介质中传播时，能量损耗亦不同。本研究实验过程中发现:96孔板中培养液存在与否对激光能量损耗不产生影响，但由于温差缘故，激光照射时96孔板板盖内表面会形成水雾，水雾的存在影响细胞实际接收的激光能量。因此，每次实验过程中均通过光功率计对细胞实际接受的激光功率进行测量，保证每次实验细胞接收的能量相同。

实验结果表明，激光照射24 h后，照射组细胞增殖速度比对照组显著加快，说明658 nm激光照射促进hPDLCs增殖，同以往文献相符［7］。但是，激光照射48 h后，照射组细胞OD值较对照组减低，可能是由于细胞生长过快而产生接触抑制的缘故。因为在本实验中细胞接种浓度为 2.0×104cells/mL，较Kreisler M等实验中细胞接种浓度要高，并且96孔板每孔生长面积有限，激光照射后，hPDLCs快速生长更容易发生接触抑制。由于hPDLCs可以复层生长，激光照射hPDLCs 96 h后，照射组细胞OD值高于对照组细胞，且照射组同对照组相比具有显著性差异。本实验从正反两方面说明激光能量密度为1.86 J/cm2和 3.72 J/cm2时，658 nm 激光照射能显著促进hPDLCs增殖，但不同能量密度照射组之间无明显差异。

碱性磷酸酶是一种分布于细胞膜的钙结合蛋白，可促进细胞向成骨细胞的分化，其与矿物质的形成改建密切相关，在矿化过程中发挥重要作用。hPDLCs在矿化液诱导后形成矿化结节，说明hPDLCs具有向成骨细胞样细胞分化的能力。本实验中，658 nm激光照射hPDLCs后，细胞培养液中ALP活性较对照组增高，提示LLLT具有促进hPDLCs中ALP活性表达，可能促进其向成骨细胞的分化，这同Stein A 等人结果一致［8］。本实验表明，1.86 J/cm2能量密度能促进hPDLCs分泌ALP，但同对照组相比，两者无明显差异，而能量密度为3.72 J/cm2的实验组同对照组间具有显著差异。说明hPDLCs只有在接受一定能量密度的激光照射才能促进其分泌ALP。其可能原因是由于激光照射hPDLC作为一种物理刺激，只有在刺激强度达到阈值后才能产生相应的生物效应。其次，Moore P等指出LLLT的生物学刺激效应同激光器的波长有关［9］。

纤维连接蛋白(Fibronectin，FN)作为细胞外基质中粘附糖蛋白，与细胞的生长、迁移、分化过程有关。牙周新附着的形成在于牙周膜细胞较上皮细胞优先占据根面以免上皮结合。本实验结果表明，能量密度为1.86 J/cm2时，658 nm激光照射能促进hPDLCs分泌FN。Kim等［10］通过动物实验表明牙齿移动过程中应用低剂量的激光照射能促进牙周组织中纤维连接蛋白和I型胶原蛋白的表达。我们实验中还发现，658 nm激光照射24 h，48 h后，hPDLCs分泌FN量未见明显变化，72 h后较对照组明显增高。可能的原因是激光照射hPDLCs后，细胞合成FN并分泌到培养液中需要一定的时间才能完成。此外，本实验也发现658 nm激光在能量密度1.86 J/cm2时才能促进细胞FN的合成。其可能原因是由于1.86 J/cm2能量密度的激光照射hPDLCs是一个强度适当的刺激，此时靶组织的生物效应已经达到平台期，此时接受更大的刺激也不会增强生物效应。

本实验证实，658 nm低能量激光照射促进hPDLCs增殖、ALP活性及FN合成，可能有助于牙周组织的再生和附着。但不同能量密度的激光照射对hPDLCs产生的生物效应不同。提示LLLT应用于临床时，需要选定适当的激光参数才能取得理想的疗效，有待深入研究。

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