高效液相色谱测定不同采收期罗布麻中黄酮含量

石雪萍， 吴亮亮

（1.江苏经贸职业技术学院 工程技术学院/江苏省食品安全工程技术研究开发中心，江苏 南京 210007；2.南京野生植物综合利用研究院，江苏 南京 210042）

罗布麻 （Apocynum venetum）分为红麻和白麻两种，为夹竹桃科多年生直立半灌木草本植物，是一种具有多种经济用途和生态用途的资源植物。罗布麻具有耐盐碱、耐严寒和酷暑的特性，广泛生长在盐碱、沙荒地带，集中在新疆、内蒙、甘肃、青海等省区，因最早发现于新疆罗布泊，故命名为罗布麻[1]。用罗布麻叶作饮茶及药用有悠久的历史，《中国药植图鉴》记载罗布麻：“嫩叶，蒸炒揉制后代茶，有清凉去火，防止头晕和强心的功用。”《陕西中草药》记载其具有“清凉泻火，强心利尿，降血压。治心脏病，高血压，神经衰弱，肾炎浮肿”的功效。现代研究表明，罗布麻中的有效成分主要有黄酮类、鞣质类、有机酸类、醇类、氨基酸类等[2-3]，具有降压、降脂、抗感冒、镇静安神、抗抑郁等功效[4-10]。罗布麻最主要成分为黄酮类成分。近年来国内外关于罗布麻中黄酮的研究甚多，主要有总黄酮的测定：范维刚等人研究了罗布麻叶中黄酮类化合物含量的测定[11]，刘东平研究了罗布麻黄酮测定方法[12]；黄酮的分离：耿岩玲等利用高速逆流色谱从罗布麻中分离得到了异槲皮素甙[13]；张云峰等人从罗布麻中分离得到了8种化合物，3种为黄酮类成分，其中有槲皮素和异槲皮素甙[14]。程秀丽将罗布麻的乙醇提取物经聚酰胺柱、Sephadex LH-20，反复分离纯化得到几种黄酮类化合物三叶豆苷、金丝桃苷、槲皮素、乙酰异槲皮苷与异槲皮苷[15]。作者以新疆阿拉泰地区的罗布红麻为原料，利用高效液相色谱法测定不同采收期罗布麻茶中的几种黄酮含量，旨在寻找最佳的采收期，并可根据需要选择不同的采收期，从而更加合理地利用这种戈壁珍品。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

罗布麻样品采自新疆阿拉泰。按照采收期分别标记为 1#，6 月份采摘；2#，7 月份采收；3# 样品，8月份采收；4#样品，9月份采收；5#样品，8月份采收热水浸泡。

芦丁、金丝桃苷、异槲皮素甙、槲皮素对照品（纯度≥98%），南京泽朗医药科技有限公司产品；甲醇、磷酸为HPLC级，水为纯净水。其它试剂均为分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

Agilent 1200高效液相色谱仪、二极管阵列检测器 （DAD）、安捷伦化学工作站、Zorbax保护住（H4033A）：安捷伦科技有限公司产品；JA3103N分析天平：上海明桥精密科学仪器有限公司产品；T6新世纪紫外-可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司产品。

1.3 实验方法

1.3.1 对照品溶液制备 精密称取4.8 mg异槲皮苷，5.5 mg金丝桃苷，5.4 mg芦丁和5.8 mg槲皮素，甲醇定容至10 mL，样品浓度分别为 0.48、0.55、0.54、0.58 mg/mL，并将母液稀释成5个浓度梯度的对照品溶液，待进样。

1.3.2 供试样品溶液的制备 将不同时期采摘的罗布麻叶干燥，粉碎过40目筛。分别称取1#、2#、3#、4#样品2 g，加入体积分数60%乙醇溶液100 mL，超声提取60 min，过滤取滤液；称取5#样品2 g，100 mL沸水泡制3次，合并，过滤取滤液。滤液上样前经0.45 μm膜过滤，进样。

1.3.3 色谱条件 Zorbax Eclipse C18色谱柱 （150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：v（甲醇）∶v（体积分数0.4%磷酸）=50∶50； 流量：1 mL/min； 检测波长：360 nm；柱温 35 ℃；进样量 5 μL。

2 结果分析

2.1 线性关系考察

将对照品溶液从低浓度到高浓度，依次进样，每个浓度进样3次，每次5 μL，按1.3.3的色谱条件进行HPLC分析，以色谱峰面积（Y）对进样量（X）进行回归，计算回归方程。结果见表1。

由表1看出，各对照品在一定的浓度范围内具有良好的线性关系。

2.2 精密度实验

精密吸取芦丁、金丝桃苷、异槲皮素甙、槲皮素对照品质量浓度分别为 0.48、0.55、0.54、0.58 mg/mL的对照品混合液5 μL，按照1.3.3的色谱条件进行HPLC分析。重复进样6次，测定各个对照品的峰面积，结果芦丁峰面积RSD为1.86%，金丝桃苷峰面积RSD为2.02%，异槲皮素甙峰面积RSD为2.35%，槲 皮素峰面积RSD为2.26%。表明仪器精密度良好。

表1 各对照品的线性回归方程和相关系数Table 1 Regression equation and correlation coefficient of four standard samples

2.3 稳定性实验

精密吸取 1.3.2 的供试品溶液 5 μL，于 0、4、8、12、16、20、24、48 h 分别进样， 测定芦丁的峰面积RSD为1.91%，金丝桃苷峰面积RSD为2.18%，异槲皮素甙峰面积的RSD为2.81%，槲皮素峰面积RSD为2.32%。表明该方法稳定性良好。

2.4 重复性实验

精密称取同一批罗布麻样品6份，按照1.3.2的方法制备，1.3.3的色谱条件测定。结果显示，芦丁峰面积RSD为3.20%，金丝桃苷峰面积RSD为4.82%，异槲皮素甙峰面积RSD为 3.21%，槲皮素峰面积RSD为4.35%。表明该方法的重复性良好。

2.5 回收率实验

精密吸取已知含量的罗布麻提取液，分成3组，每组按照低、中、高3个标准准确加入对照品混合液，按1.3.3的色谱条件测定。结果显示芦丁平均回收率99.1%，RSD为4.3%；金丝桃苷的回收率为91.7%，RSD为5.1%；异槲皮素甙的平均回收率为96.3%，RSD为 3.8%；槲皮素的平均回收率为115.2%，RSD为4.9%。

2.6 不同采收期罗布麻中黄酮含量测定

不同采收期的罗布麻样品按1.3.2供试品溶液制备处理，在上述色谱条件下进行分析，HPLC图谱见图1和图2。

由图1和图2可以看出，4种黄酮在所选择的HPLC条件下能够很好分开。罗布麻叶提取物中的芦丁、金丝桃苷、异槲皮素甙和槲皮素的出峰时间分别为 5.790、6.275、6.640、18.382 min。

图1 对照品的HPLC色谱Fig.1 HPLC Chromatogram of standard samples

图2 样品（3#）中的HPLC色谱Fig.2 HPLC Chromatogram of flavonoids from sample（3#）

2.7 不同采收期罗布麻中黄酮含量比较分析

参照各对照品的标准曲线，求得不同采收期的罗布麻叶样品中黄酮质量分数，并进行柱状图分析。结果见表2和图3。

图3 不同采收期罗布麻中黄酮含量柱状分析图Fig.3 Columnar graph of flavonoids content of the Apocynum venetum samples gathered in different seasons

表2 不同采收期样品中黄酮成分质量分数Table 2 Flavonoids content of the Apocynum venetum samples gathered in different seasons

由图3和表2可以看出，随着月份增加，罗布麻中黄酮含量整体呈增加趋势。这4种黄酮中，异槲皮素甙含量最高，其次是芦丁。6月份采收的罗布麻叶中没有检测出金丝桃苷，8月份采收的罗布麻茶沸水泡制液中未见槲皮素，其他3种黄酮含量比较高，说明沸水泡制能很好地溶出黄酮类物质。

3 讨论

3.1 色谱条件选择

按照甲醇磷酸不同比例作为流动相进行了比较，结果发现，当流动相为v（甲醇）∶v（体积分数0.4%磷酸）=50∶50时，各组分峰分离较好，且峰形对称性良好。在色谱柱允许的范围内，考察了温度的影响，发现随着温度升高分离效果越好。综合考虑，选择了50℃作为最佳柱温。

3.2 提取条件的选择

芦丁和金丝桃苷、异槲皮素甙极性较大，槲皮素极性较小，溶于甲醇、乙醇、微溶于水。考察了不同提取溶剂，试验结果表明体积分数60%乙醇溶液能够兼顾这四种黄酮的极性特点，再加上乙醇作为溶剂的安全性，因此用体积分数60%乙醇溶液为提取溶剂。实验同时也研究了沸水泡制罗布麻茶，对其黄酮的影响，结果发现，沸水泡制能溶出大部分黄酮类成分。因此，罗布麻叶作为茶叶用沸水泡制是合理的，且冲泡3遍，基本能溶出大部分黄酮类成分。

3.3 采收季节确定

黄酮类是一种重要的植物次生代谢产物，随着植物的生长而呈动态变化[16]。植物生长环境中的温度、水分、光照、大气、盐分、养分等都会对植物的生长产生各种各样的影响甚至胁迫，致使次生代谢产物发生变化[17]。从以上结果看出，8月份采收的罗布麻叶（叶片乌绿）含有的黄酮总量最多，但槲皮素含量甚微，可以用作加工成罗布麻茶。9月份采收的罗布麻叶（叶片呈金黄）金丝桃苷、槲皮素含量较高，可以作为罗布麻发酵茶或者罗布麻提取物的最佳原料。由此看出，研究不同采收季节罗布麻中黄酮含量，有利于更合理地利用罗布麻资源，创造更高的附加值。

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