肺积方调节CD4+CD25+Treg 细胞及T 淋巴细胞增殖与抗Lewis 肺癌移植鼠肿瘤生长作用研究

杨国良 张学进 浙江省杭州市红十字会医院肿瘤内科 杭州310003

胡丹丹 浙江中医药大学附属第三医院呼吸科

肿瘤的发展与宿主的细胞免疫状态密切相关。机体存在着多种免疫监视机制，发挥抗癌作用，包括特异性和非特异性的、细胞的和体液的免疫机制，其中以T 细胞亚群为主的细胞免疫起着重要作用。免疫治疗是肺癌综合治疗手段中重要的组成部分。施志明教授研制的肺积方，经临床长期使用研究及相关实验研究，业已证实其在改善患者症状和生存质量方面有明显作用，并能逆转肿瘤免疫逃逸，提高机体细胞免疫功能。但是该方调节肿瘤免疫的具体作用机制尚不明确。本研究通过观察该方抗Lewis 肺癌移植鼠肿瘤生长，以及对移植鼠CD4+CD25+Treg 细胞数量、T 淋巴细胞增殖的影响，探讨该方调节抗肿瘤免疫的机制，为该方的进一步研究提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 动 物 近交系C57BL/6 纯系小鼠，64 只，雄性，体质量18～22g，4～6 周龄。

1.2 药 物 肺积方由生黄芪、白术、七叶一枝花、萸肉、仙灵脾等组成，由本院中药房提供。常规水煎，浓缩至生药含量为2.0g/mL，4℃保存。顺铂（DDP）：20mg/瓶。

1.3 细胞培养 Lewis 肺癌细胞株由北京酶阿查生物控股有限公司提供，常规培养于含10%小牛血清的IMDM 培养液中，置37℃、5%CO2培养箱培养。

1.4 小鼠Lewis 肺癌模型建立 将制备好的Lewis肺癌细胞悬液以0.2mL/只接种于小鼠右腋皮下（约含活细胞数1.5×106个）

1.5 动物分组及给药 接种后小鼠随机分为对照组、DDP 组、肺积方组、综合组，每组16 只。接种后第7天（肿瘤长至直径约5mm 时）开始给药，给药剂量根据人鼠体表面积折合法计算。对照组以生理盐水（10mL/kg）灌胃14天；DDP 组DDP 溶液1mL（5mg/kg）腹腔注射化疗，隔天1天，共3 次，同时生理盐水0.2mL 灌胃21天；肺积方组予肺积方药液40g/kg 灌胃21天。综合组的化疗同DDP 组，肺积方用法同肺积方组。各组均每天灌胃1 次。

1.6 观察成瘤率、平均瘤重、肿瘤体积 接种肿瘤细胞后第7天起，每3天检测小鼠体质量，每3天用游标卡尺测量每只小鼠腋下肿瘤长径（L）和短径（W），Tumor volume=（L×W）2/2

1.7 指标检测 给药后第10、21天，分两批（每批每组各8 只），对小鼠进行下列检测。

1.7.1 MTT 法检测胸腺和脾脏T 淋巴细胞增殖情况无菌状态下取小鼠胸腺和脾脏，制成1×107/mL的细胞悬液，加入96 孔培养板，每孔100μL，加入ConA 使终浓度为5μg/mL，置37℃、5%CO2培养箱内培养48h 后每孔加入5mg/mL MTT 10μL，继续培养4h，每孔加入DMSO（二甲基亚砜）溶解液100μL，在酶标仪上于570nm 读取吸光度（OD 值）。

1.7.2 流式细胞术检测胸腺和脾脏CD4+CD25+Treg细胞含量 通过流式细胞术检测胸腺和脾脏CD4+CD25+Treg 细胞数量。将小鼠颈椎脱臼处死，常规制备胸腺和脾细胞悬液；Tris-NH4Cl 溶胀红细胞，计数，取106个细胞（200μL 体积），加入PE-anti-CD4+5μL 和FITC-anti-CD25+2μL，避光冰浴45min，冷PBS 洗涤2 次后，用流式细胞仪检测胸腺和脾脏CD4+CD25+Treg 细胞数量。

1.8 统计学方法 应用SPSS13.0 软件进行统计分析，计量资料采用t 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 Lewis 肺癌荷瘤小鼠肿瘤体积、体质量、肿瘤抑制率变化 给药21天后，小鼠肿瘤体积、体质量、肿瘤生长抑制率变化见图1～3。以综合组对荷瘤小鼠肿瘤生长抑制最明显。

图1 Lewis 肺癌荷瘤小鼠给药21天肿瘤体积变化

图2 Lewis 肺癌荷瘤小鼠给药21天体质量变化

图3 Lewis 肺癌荷瘤小鼠给药21天肿瘤生长抑制率变化

2.2 Lewis 肺癌荷瘤小鼠T 细胞增殖功能变化 荷瘤小鼠脾脏T 淋巴细胞增殖指数变化：第10、21天DDP 组、肺积方组、综合组T 淋巴细胞增殖与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），其中肺积方组、综合组T 淋巴细胞增殖指数增高，而DDP 组T 淋巴细胞增殖指数降低；DDP 组给药后第21天与第10天比较，T 淋巴细胞增殖指数降低明显（P＜0.05）；而肺积方组、综合组第21天与第10天T 淋巴细胞增殖指数组内比较无明显变化（P＞0.05）。见表1。

荷瘤小鼠胸腺T 淋巴细胞增殖指数变化：第10、21天DDP 组、肺积方组、综合组T 淋巴细胞增殖指数与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），其中肺积方组、综合组T 淋巴细胞增殖指数增高，而DDP 组T 淋巴细胞增殖指数降低；DDP 组给药第21天与给药第10天比较，T 淋巴细胞增殖指数降低明显（P＜0.05）；而肺积方组、综合组T 淋巴细胞增殖指数第21天与第10天组内比较无明显变化（P＞0.05）。见表2。

表1 小鼠脾脏T 淋巴细胞增殖指数比较（）

表1 小鼠脾脏T 淋巴细胞增殖指数比较（）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与DDP 组比较，▲P＜0.05；与DDP 组和肺积方组比较，△P＜0.05；与同组第10天比较，#P＜0.05

表2 四组小鼠胸腺T 淋巴细胞增殖指数比较（）

表2 四组小鼠胸腺T 淋巴细胞增殖指数比较（）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与DDP 组比较，▲P＜0.05；与DDP 组、肺积方组比较，△P＜0.05

2.3 Lewis 肺癌荷瘤小鼠胸腺和脾脏CD4+CD25+Terg 细胞比例 荷瘤小鼠胸腺CD4+CD25+Terg 细胞比例变化：第10天、21天DDP 组、肺积方组、综合组CD4+CD25+Terg 细胞比例与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），肺积方组、综合组、DDP 组CD4+CD25+Terg 细胞比例均降低；DDP 组第21天与给药后第10天比较，CD4+CD25+Terg 细胞比例升高（P＜0.05）；而肺积方组、综合组第21天与第10天比较无明显变化（P＞0.05）；综合组与肺积方组、DDP 组比较脾脏CD4+CD25+Terg 细胞比例明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 四组小鼠胸腺CD4+CD25+Treg 细胞比例比较（）

表3 四组小鼠胸腺CD4+CD25+Treg 细胞比例比较（）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与DDP 组比较，▲P＜0.05；与DDP 组、肺积方组比较，△P＜0.05；与同组第10天比较，#P＜0.05

荷瘤小鼠脾脏CD4+CD25+Terg 细胞比例变化：第10、21天DDP 组、肺积方组、综合组CD4+CD25+Terg细胞比例与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），肺积方组、综合组、DDP 组CD4+CD25+Terg 细胞比例均降低；DDP 组第21天与给药后第10天比较，CD4+CD25+Terg 细胞比例升高（P ＜0.05）；而肺积方组、综合组第21天与第10天比较无明显变化（P＞0.05）；综合组与肺积方组、DDP 组脾脏CD4+CD25+Terg 细胞比例比较，差异有统计学意义（P＜0.05），综合组比例较低；肺积方组第10天脾脏CD4+CD25+Terg 细胞比例与DDP 组第10天比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表4 四组小鼠脾脏CD4+CD25+Treg 细胞比例比较（）

表4 四组小鼠脾脏CD4+CD25+Treg 细胞比例比较（）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与DDP 组比较，▲P＜0.05；与DDP 组、肺积方组比较，△P＜0.05；与同组第10天比较，#P＜0.05

3 讨论

肺癌为世界范围内高发的恶性肿瘤，死亡率高，晚期患者生存期短暂。肺癌治疗目前已处于平台期，手术放化疗治疗效果现在难以提高，靶向药物治疗取得了一定的治疗效果，但仍难以大幅提高患者生存期。肺癌发生与肿瘤细胞逃避免疫监视密切相关，而从免疫角度探索肺癌治疗新方法可以为肺癌治疗提供新的靶点。

CD4+CD25+调节性T 细胞（regulatory T cell，Treg）是一类具有独特免疫调节作用的T 细胞。由Sakaguchi 等[1]首次报道。已有相关研究表明，在某些恶性肿瘤中，CD4+CD25+调节性T 细胞可导致免疫功能混乱，其水平升高与免疫抑制、肿瘤进展有关[2]。

肿瘤局部存在多种类型的免疫抑制性细胞，其中调节性T 细胞在肿瘤的发生、发展过程中发挥着极为重要的作用。Treg 通过多种机制抑制免疫效应细胞的功能，是肿瘤免疫逃逸的关键因素之一。这些机制包括分泌抑制性细胞因子抑制效应细胞功能、分泌颗粒酶和穿孔素杀伤效应细胞、干扰效应细胞的代谢功能，以及通过与树突状细胞的相互作用影响Treg的分化和增殖。Treg 是一个异质性的群体，目前已经发现了多种Treg 亚群，包括自然产生的CD4+CD25+Treg、抗原诱导的Thl、Th3 细胞以及抗原特异性CD4+Treg。此外，还有CD8+Treg、CD4+CD25-Treg 等。在肿瘤微环境中，报道最多的是CD4+CD25+Treg，多种肿瘤包括肺癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、胃癌、淋巴瘤等均发现这群细胞的存在，其数量因肿瘤的不同而异，而肿瘤局部Treg的数量与肿瘤的预后密切相关[3]。

近年来，针对肺癌患者CD4+CD25+Treg 细胞的检测及观察显示，中晚期非小细胞肺癌患者外周血CD4+CD25+Treg 细胞水平明显高于正常健康人群[4-5]。肺癌患者外周血中CD4+CD25+Treg 细胞数量与临床分期关系密切，肺癌患者体内CD4+CD25+Treg 细胞比例上升可能与肺癌发病有关，其数量变化可反应肺癌患者荷瘤状态[6]。对于不同病理分型的肺癌，CD4+CD25+调节性T 细胞比例也有所不同：腺癌患者比例较高，其次是鳞癌，混合型最低，且肺癌患者随着病程的进展，CD4+CD25+Treg 细胞也逐渐增高；有淋巴结转移者明显高于未转移者[7]。晚期肺癌患者免疫应答受到抑制的原因可能是，肿瘤在其周围形成了一个独立的微环境，在这个微环境里，所有的细胞似乎都致力于一个目标，即支持和加速肿瘤的生长[8]。而CD4+CD25+Treg 细胞则正因为其可导致免疫功能混乱，且水平升高与免疫抑制、肿瘤进展有关[9]，故在肺癌的发生、发展中起重要作用，其比例增高可以反映肺癌患者免疫系统存在抑制状态，是抑制机体产生有效的抗肿瘤免疫应答，最终导致肿瘤免疫逃逸，使肿瘤进行性生长的重要因素之一。下调CD4+CD25+Treg 细胞将有助于提高机体抗肿瘤免疫，减轻肿瘤负荷。

目前针对化疗对T 细胞亚群影响的文献报道较多，但大部分研究均只针对CD3、CD4、CD8 等T 细胞化疗前后的比例变化，而对CD4+CD25+Treg 细胞未见相关文献报道。而开展肿瘤CD4+CD25+Treg 细胞的研究可为制定有效的抗肿瘤生物治疗方法提供帮助。本研究表明，化疗后肺癌移植鼠的T 细胞增殖受到明显抑制，但随着T 细胞增殖能力的恢复，CD4+CD25+Treg 细胞比值明显升高，这是否为化疗后肿瘤进展的因素之一，本研究尚不能评价，但本实验结果同时表明综合组CD4+CD25+Treg 细胞比值明显低于其他三组，这说明化疗联合中药治疗在调节肿瘤T 细胞增殖时是有选择性的，但这种选择作用的靶点是什么，仍需进一步实验研究。

［1］Sakaguchi S，Sakaguchi N，Asano M，et al.Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expessing IL-2 recep toralphachains（CD25）.Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases［J］.J Immunol，1995，155（3）：1151-1164.

［2］Okita R，Saeki T，Takashima S，et al.CD4+CD25+regulatory T cells in the peripheral blood of patients with breast cancer and non-small cell lung cancer［J］.Oncol Rep，2005，14（5）：1269 -1273.

［3］Shimizu J，Yammaki S，Sakaguchi S.Induction of tumor immunity by removing CIY25+CIM+T cells：a common basis betw∞n tumor immunity and antoimmunity［J］.J Immunol，1999，163（10）：5211-5218.

［4］Wolf AM，Wolf D，Steurer M，et al.Increase in regulatory T cells in the peripheral blood of cancer patients［J］.Clin Cancer Res，2003，9：606-612.

［5］黄云胜，施志明.CD4+CD25+Tr 细胞与非小细胞肺癌相关性研究［J］.现代肿瘤医学，2007，15（7）：928-929.

［6］刘荣军，葛棣，丁建勇，等.肺癌患者CD4+CD25+high Foxp3+调节性T 细胞的格局变化及意义［J］.中国免疫学杂志，2006，22（6）：531-534.

［7］Stuhler G，Walden P.癌症免疫治疗［M］.朱立平，张伟译.北京：化学工业出版社，2004：85.

［8］Okita R，Saeki T，Takashima S，et al.CD4+CD25+regulatory Tcells in the peripheral blood of patients with breast cancer and non-small cell lung cancer［J］.Oncol Rep，2005，14（5）：1269-1273.