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肺积方调节CD4+CD25+Treg 细胞及T 淋巴细胞增殖与抗Lewis 肺癌移植鼠肿瘤生长作用研究

2013-11-08杨国良张学进浙江省杭州市红十字会医院肿瘤内科杭州310003

浙江中西医结合杂志 2013年8期
关键词:方组荷瘤胸腺

杨国良 张学进 浙江省杭州市红十字会医院肿瘤内科 杭州310003

胡丹丹 浙江中医药大学附属第三医院呼吸科

肿瘤的发展与宿主的细胞免疫状态密切相关。机体存在着多种免疫监视机制,发挥抗癌作用,包括特异性和非特异性的、细胞的和体液的免疫机制,其中以T 细胞亚群为主的细胞免疫起着重要作用。免疫治疗是肺癌综合治疗手段中重要的组成部分。施志明教授研制的肺积方,经临床长期使用研究及相关实验研究,业已证实其在改善患者症状和生存质量方面有明显作用,并能逆转肿瘤免疫逃逸,提高机体细胞免疫功能。但是该方调节肿瘤免疫的具体作用机制尚不明确。本研究通过观察该方抗Lewis 肺癌移植鼠肿瘤生长,以及对移植鼠CD4+CD25+Treg 细胞数量、T 淋巴细胞增殖的影响,探讨该方调节抗肿瘤免疫的机制,为该方的进一步研究提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 动 物 近交系C57BL/6 纯系小鼠,64 只,雄性,体质量18~22g,4~6 周龄。

1.2 药 物 肺积方由生黄芪、白术、七叶一枝花、萸肉、仙灵脾等组成,由本院中药房提供。常规水煎,浓缩至生药含量为2.0g/mL,4℃保存。顺铂(DDP):20mg/瓶。

1.3 细胞培养 Lewis 肺癌细胞株由北京酶阿查生物控股有限公司提供,常规培养于含10%小牛血清的IMDM 培养液中,置37℃、5%CO2培养箱培养。

1.4 小鼠Lewis 肺癌模型建立 将制备好的Lewis肺癌细胞悬液以0.2mL/只接种于小鼠右腋皮下(约含活细胞数1.5×106个)

1.5 动物分组及给药 接种后小鼠随机分为对照组、DDP 组、肺积方组、综合组,每组16 只。接种后第7天(肿瘤长至直径约5mm 时)开始给药,给药剂量根据人鼠体表面积折合法计算。对照组以生理盐水(10mL/kg)灌胃14天;DDP 组DDP 溶液1mL(5mg/kg)腹腔注射化疗,隔天1天,共3 次,同时生理盐水0.2mL 灌胃21天;肺积方组予肺积方药液40g/kg 灌胃21天。综合组的化疗同DDP 组,肺积方用法同肺积方组。各组均每天灌胃1 次。

1.6 观察成瘤率、平均瘤重、肿瘤体积 接种肿瘤细胞后第7天起,每3天检测小鼠体质量,每3天用游标卡尺测量每只小鼠腋下肿瘤长径(L)和短径(W),Tumor volume=(L×W)2/2

1.7 指标检测 给药后第10、21天,分两批(每批每组各8 只),对小鼠进行下列检测。

1.7.1 MTT 法检测胸腺和脾脏T 淋巴细胞增殖情况无菌状态下取小鼠胸腺和脾脏,制成1×107/mL的细胞悬液,加入96 孔培养板,每孔100μL,加入ConA 使终浓度为5μg/mL,置37℃、5%CO2培养箱内培养48h 后每孔加入5mg/mL MTT 10μL,继续培养4h,每孔加入DMSO(二甲基亚砜)溶解液100μL,在酶标仪上于570nm 读取吸光度(OD 值)。

1.7.2 流式细胞术检测胸腺和脾脏CD4+CD25+Treg细胞含量 通过流式细胞术检测胸腺和脾脏CD4+CD25+Treg 细胞数量。将小鼠颈椎脱臼处死,常规制备胸腺和脾细胞悬液;Tris-NH4Cl 溶胀红细胞,计数,取106个细胞(200μL 体积),加入PE-anti-CD4+5μL 和FITC-anti-CD25+2μL,避光冰浴45min,冷PBS 洗涤2 次后,用流式细胞仪检测胸腺和脾脏CD4+CD25+Treg 细胞数量。

1.8 统计学方法 应用SPSS13.0 软件进行统计分析,计量资料采用t 检验,以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 Lewis 肺癌荷瘤小鼠肿瘤体积、体质量、肿瘤抑制率变化 给药21天后,小鼠肿瘤体积、体质量、肿瘤生长抑制率变化见图1~3。以综合组对荷瘤小鼠肿瘤生长抑制最明显。

图1 Lewis 肺癌荷瘤小鼠给药21天肿瘤体积变化

图2 Lewis 肺癌荷瘤小鼠给药21天体质量变化

图3 Lewis 肺癌荷瘤小鼠给药21天肿瘤生长抑制率变化

2.2 Lewis 肺癌荷瘤小鼠T 细胞增殖功能变化 荷瘤小鼠脾脏T 淋巴细胞增殖指数变化:第10、21天DDP 组、肺积方组、综合组T 淋巴细胞增殖与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05),其中肺积方组、综合组T 淋巴细胞增殖指数增高,而DDP 组T 淋巴细胞增殖指数降低;DDP 组给药后第21天与第10天比较,T 淋巴细胞增殖指数降低明显(P<0.05);而肺积方组、综合组第21天与第10天T 淋巴细胞增殖指数组内比较无明显变化(P>0.05)。见表1。

荷瘤小鼠胸腺T 淋巴细胞增殖指数变化:第10、21天DDP 组、肺积方组、综合组T 淋巴细胞增殖指数与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05),其中肺积方组、综合组T 淋巴细胞增殖指数增高,而DDP 组T 淋巴细胞增殖指数降低;DDP 组给药第21天与给药第10天比较,T 淋巴细胞增殖指数降低明显(P<0.05);而肺积方组、综合组T 淋巴细胞增殖指数第21天与第10天组内比较无明显变化(P>0.05)。见表2。

表1 小鼠脾脏T 淋巴细胞增殖指数比较()

表1 小鼠脾脏T 淋巴细胞增殖指数比较()

注:与对照组比较,*P<0.05;与DDP 组比较,▲P<0.05;与DDP 组和肺积方组比较,△P<0.05;与同组第10天比较,#P<0.05

表2 四组小鼠胸腺T 淋巴细胞增殖指数比较()

表2 四组小鼠胸腺T 淋巴细胞增殖指数比较()

注:与对照组比较,*P<0.05;与DDP 组比较,▲P<0.05;与DDP 组、肺积方组比较,△P<0.05

2.3 Lewis 肺癌荷瘤小鼠胸腺和脾脏CD4+CD25+Terg 细胞比例 荷瘤小鼠胸腺CD4+CD25+Terg 细胞比例变化:第10天、21天DDP 组、肺积方组、综合组CD4+CD25+Terg 细胞比例与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05),肺积方组、综合组、DDP 组CD4+CD25+Terg 细胞比例均降低;DDP 组第21天与给药后第10天比较,CD4+CD25+Terg 细胞比例升高(P<0.05);而肺积方组、综合组第21天与第10天比较无明显变化(P>0.05);综合组与肺积方组、DDP 组比较脾脏CD4+CD25+Terg 细胞比例明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),见表3。

表3 四组小鼠胸腺CD4+CD25+Treg 细胞比例比较()

表3 四组小鼠胸腺CD4+CD25+Treg 细胞比例比较()

注:与对照组比较,*P<0.05;与DDP 组比较,▲P<0.05;与DDP 组、肺积方组比较,△P<0.05;与同组第10天比较,#P<0.05

荷瘤小鼠脾脏CD4+CD25+Terg 细胞比例变化:第10、21天DDP 组、肺积方组、综合组CD4+CD25+Terg细胞比例与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05),肺积方组、综合组、DDP 组CD4+CD25+Terg 细胞比例均降低;DDP 组第21天与给药后第10天比较,CD4+CD25+Terg 细胞比例升高(P <0.05);而肺积方组、综合组第21天与第10天比较无明显变化(P>0.05);综合组与肺积方组、DDP 组脾脏CD4+CD25+Terg 细胞比例比较,差异有统计学意义(P<0.05),综合组比例较低;肺积方组第10天脾脏CD4+CD25+Terg 细胞比例与DDP 组第10天比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 四组小鼠脾脏CD4+CD25+Treg 细胞比例比较()

表4 四组小鼠脾脏CD4+CD25+Treg 细胞比例比较()

注:与对照组比较,*P<0.05;与DDP 组比较,▲P<0.05;与DDP 组、肺积方组比较,△P<0.05;与同组第10天比较,#P<0.05

3 讨论

肺癌为世界范围内高发的恶性肿瘤,死亡率高,晚期患者生存期短暂。肺癌治疗目前已处于平台期,手术放化疗治疗效果现在难以提高,靶向药物治疗取得了一定的治疗效果,但仍难以大幅提高患者生存期。肺癌发生与肿瘤细胞逃避免疫监视密切相关,而从免疫角度探索肺癌治疗新方法可以为肺癌治疗提供新的靶点。

CD4+CD25+调节性T 细胞(regulatory T cell,Treg)是一类具有独特免疫调节作用的T 细胞。由Sakaguchi 等[1]首次报道。已有相关研究表明,在某些恶性肿瘤中,CD4+CD25+调节性T 细胞可导致免疫功能混乱,其水平升高与免疫抑制、肿瘤进展有关[2]。

肿瘤局部存在多种类型的免疫抑制性细胞,其中调节性T 细胞在肿瘤的发生、发展过程中发挥着极为重要的作用。Treg 通过多种机制抑制免疫效应细胞的功能,是肿瘤免疫逃逸的关键因素之一。这些机制包括分泌抑制性细胞因子抑制效应细胞功能、分泌颗粒酶和穿孔素杀伤效应细胞、干扰效应细胞的代谢功能,以及通过与树突状细胞的相互作用影响Treg的分化和增殖。Treg 是一个异质性的群体,目前已经发现了多种Treg 亚群,包括自然产生的CD4+CD25+Treg、抗原诱导的Thl、Th3 细胞以及抗原特异性CD4+Treg。此外,还有CD8+Treg、CD4+CD25-Treg 等。在肿瘤微环境中,报道最多的是CD4+CD25+Treg,多种肿瘤包括肺癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、胃癌、淋巴瘤等均发现这群细胞的存在,其数量因肿瘤的不同而异,而肿瘤局部Treg的数量与肿瘤的预后密切相关[3]。

近年来,针对肺癌患者CD4+CD25+Treg 细胞的检测及观察显示,中晚期非小细胞肺癌患者外周血CD4+CD25+Treg 细胞水平明显高于正常健康人群[4-5]。肺癌患者外周血中CD4+CD25+Treg 细胞数量与临床分期关系密切,肺癌患者体内CD4+CD25+Treg 细胞比例上升可能与肺癌发病有关,其数量变化可反应肺癌患者荷瘤状态[6]。对于不同病理分型的肺癌,CD4+CD25+调节性T 细胞比例也有所不同:腺癌患者比例较高,其次是鳞癌,混合型最低,且肺癌患者随着病程的进展,CD4+CD25+Treg 细胞也逐渐增高;有淋巴结转移者明显高于未转移者[7]。晚期肺癌患者免疫应答受到抑制的原因可能是,肿瘤在其周围形成了一个独立的微环境,在这个微环境里,所有的细胞似乎都致力于一个目标,即支持和加速肿瘤的生长[8]。而CD4+CD25+Treg 细胞则正因为其可导致免疫功能混乱,且水平升高与免疫抑制、肿瘤进展有关[9],故在肺癌的发生、发展中起重要作用,其比例增高可以反映肺癌患者免疫系统存在抑制状态,是抑制机体产生有效的抗肿瘤免疫应答,最终导致肿瘤免疫逃逸,使肿瘤进行性生长的重要因素之一。下调CD4+CD25+Treg 细胞将有助于提高机体抗肿瘤免疫,减轻肿瘤负荷。

目前针对化疗对T 细胞亚群影响的文献报道较多,但大部分研究均只针对CD3、CD4、CD8 等T 细胞化疗前后的比例变化,而对CD4+CD25+Treg 细胞未见相关文献报道。而开展肿瘤CD4+CD25+Treg 细胞的研究可为制定有效的抗肿瘤生物治疗方法提供帮助。本研究表明,化疗后肺癌移植鼠的T 细胞增殖受到明显抑制,但随着T 细胞增殖能力的恢复,CD4+CD25+Treg 细胞比值明显升高,这是否为化疗后肿瘤进展的因素之一,本研究尚不能评价,但本实验结果同时表明综合组CD4+CD25+Treg 细胞比值明显低于其他三组,这说明化疗联合中药治疗在调节肿瘤T 细胞增殖时是有选择性的,但这种选择作用的靶点是什么,仍需进一步实验研究。

[1]Sakaguchi S,Sakaguchi N,Asano M,et al.Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expessing IL-2 recep toralphachains(CD25).Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases[J].J Immunol,1995,155(3):1151-1164.

[2]Okita R,Saeki T,Takashima S,et al.CD4+CD25+regulatory T cells in the peripheral blood of patients with breast cancer and non-small cell lung cancer[J].Oncol Rep,2005,14(5):1269 -1273.

[3]Shimizu J,Yammaki S,Sakaguchi S.Induction of tumor immunity by removing CIY25+CIM+T cells:a common basis betw∞n tumor immunity and antoimmunity[J].J Immunol,1999,163(10):5211-5218.

[4]Wolf AM,Wolf D,Steurer M,et al.Increase in regulatory T cells in the peripheral blood of cancer patients[J].Clin Cancer Res,2003,9:606-612.

[5]黄云胜,施志明.CD4+CD25+Tr 细胞与非小细胞肺癌相关性研究[J].现代肿瘤医学,2007,15(7):928-929.

[6]刘荣军,葛棣,丁建勇,等.肺癌患者CD4+CD25+high Foxp3+调节性T 细胞的格局变化及意义[J].中国免疫学杂志,2006,22(6):531-534.

[7]Stuhler G,Walden P.癌症免疫治疗[M].朱立平,张伟译.北京:化学工业出版社,2004:85.

[8]Okita R,Saeki T,Takashima S,et al.CD4+CD25+regulatory Tcells in the peripheral blood of patients with breast cancer and non-small cell lung cancer[J].Oncol Rep,2005,14(5):1269-1273.

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