高通量筛选污水中的硝化细菌

赵翠娟 ，宋文军，朱高雄，魏纪平，李博志 宋瓘兰，闫春燕，龚 忱

（1.天津商业大学 生物技术与食品科学学院，天津 300134；2.天津市兴源环境技术工程有限公司，天津 300384；3.天津清鉴生物科技有限公司，天津 300384）

氮循环是水体循环的重要组成部分，其中氨氮是造成水体污染的主要污染物之一，同时也是引起水体富营养化和减弱水体自净能力的主要原因之一[1].因此，降解污水中的氨氮对维持水体清洁具有重要意义[2].生物脱氮技术作为去除污水中氮素污染的最有效方法成为水处理领域的一个研究热点[3-5]，目前被认为是具有较高可行性和最有前途的水体脱氮方法.传统的生物脱氮由硝化作用和反硝化作用共同完成[6]，硝化作用又包括2 个步骤：将氨转化为亚硝酸盐和亚硝酸盐转化为硝酸盐.这2个步骤分别由亚硝化细菌和硝化细菌完成[7-8]，这一领域的研究较多[9-11].硝化细菌在生物硝化脱氨中起主要作用，它直接影响硝化的效果和生物脱氨的效率[12].但仅采用传统方法筛选硝化细菌还远不能达到当前的社会需求，而且耗费时间长、效率低.因此，高效快速地筛选硝化细菌是目前急需解决的问题.

在此背景下，本课题组研究了一种新型的硝化细菌的筛选方法，该方法不但达到了快速筛选的目的，最重要的是还能高通量筛选硝化细菌，这对于后续的污水处理具有理论和现实意义.

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 样品

该研究的污水样品取自天津市纪庄子污水处理厂的曝气池，筛选出的菌株以“JZZ-”开头、依次用阿拉伯数字1～100 对其进行命名，顺序随机而定，无特殊含义.氨氮、硝态氮和亚硝态氮的鉴定用氨氮、亚硝酸盐、硝酸盐快速测定试剂盒测定，该试剂盒由北京兰康保技术有限公司提供.

1.1.2 培养基

（1）硝化细菌富集培养基：（NH4）2SO40.496 g，KH2PO40.825 g，Na2HPO41.032 g，MgSO·47H2O 1.6 g，CaCl2·2H2O 0.2 g，C6H6O61.8 g，CaCO36.4 g，NaHCO30.078 g，微量元素Ⅰ（FeSO44 g，EDTA 4 g），微量元素Ⅱ（EDTA 1.2 g，ZnSO4·7H2O 0.52 g，CoCl·6H2O 0.25 g，MnCl20.724 g，CuSO4·5H2O 0.24 g，Na2MoO4·2H2O 0.32 g，NiCl·26H2O 0.18 g，H3BO30.016 g），蒸馏水1 000 mL，pH 值为8.0～8.2（用质量分数5%的碳酸钠和盐酸调pH 值）.

（2）硝化细菌分离培养基：（NH4）2SO40.496 g，KH2PO40.825 g，Na2HPO41.032 g，MgSO4·7H2O 1.6 g，CaCl2·2H2O 0.2 g，NaHCO30.078 g，余同（1）.

（3）硝化细菌鉴定培养基：（NH4）2SO40.496 g，CH3COONa 8 g，KH2PO40.825 g，Na2HPO41.032 g，MgSO4·7H2O 1.6 g，CaCl2·2H2O 0.2 g，NaHCO30.078 g，余同（1）.

以上所用培养基若是固体培养基则加入质量分数1.7%～2.0%的琼脂，且都在115 ℃条件下灭菌25 min.

1.2 方法

1.2.1 细菌的驯化

取污水样品100 mL 倒入三角瓶中，每隔6 h替换1 次人工培养基，加入培养基的量依次为0、20%、40%、60%、80%、100%，置于27 ℃、170 r/min下振荡培养.

1.2.2 硝化细菌的初筛

将菌液进行梯度稀释，选取3 个浓度梯度1.0×104、1.0×105、1.0×106涂布到固体分离培养基上（每个稀释度做3 个重复），30 ℃培养箱中培养24 h.再从涂布的平板上挑取菌落在固体分离培养基上进行划线分纯，30 ℃培养箱中培养24 h，重复此步骤，直到得到单菌落为止.以上操作均在无菌条件下进行.

1.2.3 硝化细菌的富集

用接种环将初筛的单菌落接种到装有0.8 mL富集培养基的菌株富集管中，将菌株富集管盖拧紧装入冻存盒，再将其平放入摇床，30 ℃、170 r/min下振荡培养24 h.

1.2.4 高通量验证硝化细菌

微孔板显色鉴定法：取无菌的装有鉴定培养基的96 孔深孔培养板，用排枪向每孔接入20 μL 富集菌液，28 ℃、150 r/min 下振荡培养24 h，不加菌液的装有鉴定培养基的孔作为空白对照组.

氨氮、亚硝态氮、硝态氮的快速测定方法：本方法为氨氮试剂盒、硝酸盐和亚硝酸盐试剂盒对菌液进行快速目视半定量鉴定.根据试剂盒中的指示向装有菌液的孔中滴加氨氮试剂（Ⅰ）1 滴，震荡均匀，再滴加氨氮试剂（Ⅱ）1 滴，摇匀放置5 min，自上而下与该试剂盒提供的标准比色卡根据颜色深浅测定菌液中的氨氮，深黄色用“++”表示，浅黄色用“+”，颜色无变化则为阴性，用“-”表示.同样的方法，向孔中加入1 小勺亚硝酸盐试剂，摇动使其溶解，静置5 min 后，进行目视比色，深红色用“++”表示，浅红色或粉红色用“+”，颜色无变化则为阴性，用“－”表示.向孔中加入1 小勺硝酸盐试剂，振摇1 min，放置15 min 测定出硝态氮的含量，深红色用“++”表示，浅红色或粉红色用“+”，颜色无变化则为阴性，用“－”表示.这种方法能同时鉴定几十株甚至上百株硝化细菌，实现对硝化细菌的高通量、快速筛选.

1.2.5 硝化细菌的保存

向菌株富集管中剩余的菌液中加入等体积的体积分数为40%的甘油，震荡均匀，放入－20 ℃冰箱保存.

1.2.6 复筛

将初筛得到的硝化细菌进行复筛，即将筛选到的硝化细菌接到化学需氧量（COD）为167 mg/L、氨氮为86 mg/L 的市政污水中，将其放入摇床，在28 ℃、170 r/min 条件下振荡培养24 h，再用国标法测定COD 和氨氮的降解率[13-14].

2 结果与分析

2.1 初筛

通过分离培养基筛选出了94 株单菌，将这些单菌分别接到装有鉴定培养基的96 孔深孔培养板中，然后用各试剂盒对氨氮、亚硝酸盐、硝酸盐进行验证，有41 株菌被初步确定为硝化细菌，它们具体的硝化特性如表1 所示.

表1 41 个菌株的硝化特性Tab.1 Nitrification characteristics of 41 strains

2.2 复筛

将初筛得到的41 株硝化细菌按1.2.6 复筛方法处理，再对其进行功能验证，得到25 株高效的硝化细菌，其COD 和氨氮降解率如表2 所示.

表2 25 个菌株对污水中COD 和氨氮的降解效率Tab.2 Decomposition efficiency of COD and ammonia nitrogen in sewage of 25 strains

由表2 可知，JZZ-13、JZZ-49、JZZ-64 和JZZ-90 菌株处理污水的效果最好.

3 结论

本课题组首先通过分离培养基筛选出94 株单菌，再用氨氮、亚硝酸盐、硝酸盐试剂盒初步筛选出41 株硝化细菌.该方法大大降低了用传统方法直接筛选单菌的工作量，缩短了菌种筛选的时间.继而对这些菌进行功能验证，复筛得到了25 株对污水中的COD 和氨氮降解效果好的硝化细菌.因此，这25 株硝化细菌对污水的处理有很重要的应用价值.同时，课题组还研究了一种利用96 孔板和试剂盒高通量快速筛选硝化细菌的方法，能同时筛选出几十株甚至上百株硝化细菌，这在很大程度上降低了工作量，提高了工作效率.

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