紫草素对淋巴瘤治疗作用研究
2013-11-04翟月
翟月
四川大学华西基础医学与法医学院,四川 成都 610041
B细胞非霍奇金氏淋巴瘤是一种发病率较高,但目前治疗效果不理想的肿瘤疾病[1]。紫草素作为紫草有效成分之一,在抗炎、抗微生物及抗肿瘤等作用受到人们关注。其中,紫草素作为抗肿瘤药物,效能高,肿瘤耐药性低[2]。Rajasekar S等人报道紫草素具有抗皮肤癌作用[3]。同时,紫草素可以抑制人类结直肠癌细胞在体内外的生长[4]。另外,紫草素可以通过活性氧物质(reactive oxygen species,ROS)诱导肝癌细胞凋亡[5]。除了可以直接引起肿瘤细胞免疫原性的死亡,紫草素也能够增强基于树突细胞肿瘤疫苗的作用[6],或是通过诱导活化正常T细胞表达和分泌的调节因子(Regulated on Activation,Normal T cell Expressed and Secreted,RANTES),增强基于基因表达的肿瘤疫苗[7]。然而,紫草素在B细胞非霍奇金淋巴瘤的治疗作用并不明确。本实验以人Raji细胞,即B细胞非霍奇金淋巴瘤细胞作为对象,研究紫草素诱导Raji细胞死亡能力,进一步了解紫草素对B细胞非霍奇金淋巴瘤的抑制作用。
1.方法
1.1 细胞培养
人Burkitt’s 淋巴瘤 Raji细胞系购自美国模式培养物集存库(American type culture collection,ATCC)。Raji细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中,置于37℃,5%CO2,饱和湿度培养,每2d换一次液。
1.2 PI染色检测细胞死亡
105个/mL细胞1mL接种于12孔板,分别做对照组(CTL),紫草素组(SHK),。对照组加入1.0μLDMSO,SHK组加入10μmolL-1紫草素,孵育6h。处理完成的细胞1 000 r/min离心5 min,弃去上清。用4 ℃ 预冷的PBS洗3 次,1 000 r/min 离心5min,去上清,用100 μL结合缓冲液重新悬浮细胞,加入5μL 的碘化丙啶(PI)溶液;混匀后于室温避光孵育15 min;在反应管中加入400 μL PBS,流式细胞仪分析。
1.3 中性红检测细胞存活率
中性红可以被活细胞摄入后累积在溶酶体中,活细胞增多时摄入的中性红量增加,而细胞活性下降或细胞数减少时摄入的中性红会减少。因此,通过将5*105个/mL细胞1mL接种于12孔板,分别加入不同浓度的紫草素(0μmol·L-1,1.25μmol·L-1,2.5μmol·L-1,5μmol·L-1,10μmol·L-1,20μmol·L-1,40μmol·L-1及80μmol·L-1),孵育6h。紫草素诱导后,先用无菌PBS适当溶液洗涤2次,随后600μl细胞培养液重悬细胞,每孔加入60μl中性红染色液,细胞培养箱内孵育2小时。2小时后去除含有中性红染色液的细胞培养液,用PBS洗涤1-2次。加入200微升中性红检测裂解液,室温摇床上裂解10分钟。全波长酶标仪测定样品的A540,690nm作为参考波长[8]。
1.4 统计学分析
采用SPSS进行统计学分析,借助GraphPad Prism5软件进行作图。以上实验均重复三次,实验结果以 ±SD表示.其中统计检验以不同实验组与最对照组分别比较,采用t检验。p<0.05认为具有统计学差异。
2.结果分析
2.1 紫草素诱导Raji细胞死亡
PI单染荧光显微镜分析结果如图1所示,右图加入紫草素的实验组中PI单阳细胞,即死亡细胞数目明显多于左图实验组。由此可得出紫草素能够诱导Raji细胞发生死亡。
图1:紫草素对Raji细胞死亡的影响荧光显微镜下Raji细胞死亡情况,左图为对照组,右图为实验组。
2.2 紫草素诱导Raji细胞死亡呈浓度依赖
紫草素对Raji细胞的生长抑制作用如图3所示。中性红细胞存活率检测(图2)可知,随着药物浓度增大(0μmol·L-1,1.25μmol·L-1,2.5μmol·L-1,5μmol·L-1,10μmol·L-1,20μmol·L-1,40μmol·L-1及80μmol·L-1),紫草素对Raji细胞生长抑制作用逐渐增强。以上实验证明紫草素可诱导Raji细胞死亡,并呈浓度依赖。
图2 不同浓度紫草素对Raji细胞的生长抑制作用
中性红染色检测不同浓度紫草素对细胞生长抑制作用。*表示p<0.05,**表示p<0.01。
3.讨论
紫草素作为一种植物提取物,具有多种生物学功能,尤其是其肿瘤抑制作用受到广泛认可。紫草素抗肿瘤作用与其诱导细胞死亡的能力有关。本实验表明,紫草素可以抑制Raji细胞生长增殖,诱导Raji细胞死亡,并呈浓度依赖。这提示紫草素在非霍奇金B细胞淋巴瘤的治疗中有重要作用。但紫草素治疗肿瘤的机制,尤其是其诱导死亡的类型还有待进一步研究。尽管紫草素对于许多疾病来说是一种治疗作用显著的药物,但其毒性不可忽视,合理规范的使用紫草素十分重要。
[1]Molyneux EM,Rochford R,Griffin B,et al.Burkitt's lymphoma[J].Lancet.2012 Mar 31;379(9822):1234-44.
[2]Wu H,Xie J,Pan Q,et al.Anticancer agent shikonin is an incompetent inducer of cancer drug resistance[J].PLoS One.2013;8(1):e52706.
[3]Rajasekar S,Park da J,Park C,et al.In vitro and in vivo anticancer effects of Lithospermum erythrorhizon extract on B16F10 murine melanoma[J].J Ethnopharmacol.2012 Nov 21;144(2):335-45.
[4]Fan Y,Jin S,He J,et al.Effect of β,β-Dimethylacrylshikonin on Inhibition of Human Colorectal Cancer Cell Growth in Vitro and in Vivo[J].Int J Mol Sci.2012;13(7):9184-93.
[5]Gong K,Li W.Shikonin,a Chinese plant-derived naphthoquinone,induces apoptosis in hepatocellular carcinoma cells through reactive oxygen species:A potential new treatment for hepatocellular carcinoma[J].Free Radic Biol Med.2011 Dec 15;51(12):2259-71.
[6]Chen HM,Wang PH,et al.Shikonin induces immunogenic cell death in tumor cells and enhances dendritic cell-based cancer vaccine[J].Cancer Immunol Immunother.2012 Nov;61(11):1989-2002.
[7]Chen HM,Wang PH,Aravindaram K,et al.Shikonin enhances efficacy of a gene-based cancer vaccine via induction of RANTES[J].J Biomed Sci.2012 Apr 12;19:42.
[8]Yu J,Xie J,Mao XJ,Wang MJ,et al.Hepatoxicity of major constituents and extractions of Radix Polygoni Multiflori and Radix PolygoniMultiflori Praeparata[J].J Ethnopharmacol.2011 Oct 11;137(3):1291-9.