水产中孔雀石绿和结晶紫残留量测定前处理方法的优化研究

刘 辉 谭素娴 何艺梅

(茂名出入境检验检疫局 广东茂名 525000)

1 前言

孔雀石绿和结晶紫属于三苯甲烷类人工合成有机染料，它们及其代谢产物具有致癌性，我国于2002年将其列为水产养殖禁用药物。由于染料药物与组织蛋白结合非常强，而且鱼和脂肪组织中所含的脂肪会产生乳化作用，因此对其进行检测的关键在于前处理，单一溶剂萃取的效果不甚理想[1]。现在比较好的提取方法是离子对提取法，国标GB/T19857-2005《水产中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》[2]也是采用该方法。但在实践过程中，GB/T19857-2005存在如下不足：有机溶剂用量大，操作步骤繁杂，检测成本高等。因此，本研究结合工作需要，在国标的基础上进行了优化，创造出一种类似QuEChERS的方法[3]。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 试验样品

试验样品为送检的冻罗非鱼和冻虾。

2.1.2 仪器

Quattro Premier XE UPLC-MS/MS：Waters公司；涡旋振荡器：IKA公司；P-12平行蒸发仪：Buchi公司；超声仪：上海科导超声仪器有限公司；3-18K 高速离心机：Sigma公司。

2.1.3 试剂

乙腈、二氯甲烷、乙酸铵：Fisher，均为色谱纯；甲酸：TEDI，色谱纯；无水硫酸钠：优级纯；C18散装填料：BESEP；孔雀石绿（MG）、隐性孔雀石绿（LMG）、结晶紫（CV）、隐性结晶紫（LCV）标准品：德国Dr公司。

2.2 方法

2.2.1 仪器工作条件

2.2.1.1 色谱条件

色谱柱：Waters BEH C18 1.7μm（2.1×50 mm）；柱温：40℃；进样体积：10μL；流动相：A（5mmol/L乙酸铵+0.1% FA）-B（乙腈），梯度见表1。

表1 液相色谱梯度表

2.2.1.2 质谱条件

毛细管电压：3.5KV；源温：120℃；脱溶剂温度：450℃；脱溶剂气流速：600 L/h；采集方式：ES(+),MRM方式；离子对信息：详见GB/T19857-2005。

2.2.2 测定方法

2.2.2.1 样品制备

称取3.00g样品于50mL聚四氟乙烯离心管中，加入30ng/mL的内标混合液100μL，然后加入10.00mL乙腈，高速涡旋混合使其充分分散；再加入5mL 0.1mol/L的乙酸铵缓冲液（pH=4.5），0.5g C18散装填料，3g无水硫酸钠，涡旋混匀；超声10min，12000r/min离心5min，上清液全部倒入另一离心管中；加入5.00mL二氯甲烷，涡旋混匀，离心5min；吸取10.00mL上清液于平行蒸发仪的试管中，45℃下蒸干；准确加入1.00mL乙腈-5mmol/L乙酸铵（含0.1%FA）（1:1）洗脱、定容，过0.20μm滤膜后上机测定。

2.2.2.2 校准曲线的配制

称取空白样品6份，按2.2.2.1处理（不加内标），最终每个样品定容到2mL；混合6个空白样品的定容液作为基质液，然后用基质液作为稀释液，配制如下浓度的校准曲线：0、0.5、1、2、5、10ng/mL，内标加入量按2ng/mL加入。上机测定，各项目回归方程线性关系良好，r＞0.999。

3 结果

3.1 方法检测限

经过优化的方法所有指标的检测限均≤0.5μg/kg，与现行国标方法相当。0.5μg/kg浓度空白样品加标总离子流图见图1，从图中可见所有指标均有比较好的峰形与信噪比（S/N≥50）。

图1 0.5μg/kg加标样品总离子流图

3.2 基质抑制率比较

质谱方法容易受到基质的干扰，一个好的方法必须要将基质抑制率降到最低。基质抑制率的计算方法是：在同一浓度水平下，用流动相配制的标准响应峰面积减去用基质液配制的标准响应峰面积，然后除以用流动相配制的标准响应峰面积。方法的基质抑制率越低其净化效果就越好。本研究用相应的基质液配制浓度为1.0ng/mL的标准，每个平行测定6次计算平均值。比较GB/T19857-2005和本研究方法的基质抑制率，结果见表 2。

表2 基质抑制率比较表（n=6）

（续表）

表2显示本方法的基质抑制率与国标方法基本相当，净化效果基本一致。另外表2还显示：一方面不同的产品有不同的基质抑制率，虾的基质抑制率比较鱼略大；另一方面不同项目的基质抑制率也不同，对LMG、LCV的抑制要明显大于MG、CV。

3.3 方法的回收率与精密度

取日常检测的冻罗非鱼和冻虾作为样品，进行空白加标回收试验，加标浓度为：0.5、1.0、5.0μg/kg三个水平，每个浓度分别制备6份，上机测定计算回收率和RSD，结果见表 3。

表3 不同介质及不同浓度下的加标回收率（n=6）

3.4 实际样品测定

在过去的一年中，运用该方法对实验送检的1500多个样品进行了检测，检到阳性样品4个。阳性样品均送上级检验部门复核，复核结果和检测结果完全符合，说明该方法具有较好的稳健性和准确性。其中一个阳性样品（LMG:0.64μg/kg）冰箱留样复检图见图2。

图2 LMG阳性（0.64μg/kg）复检离子流图

4 讨论

4.1 提取缓冲液的选择

在优化过程中，考察了不同的缓冲体系（甲酸铵、乙酸铵、磷酸盐），不同的缓冲液浓度（0.05、0.1、0.2、0.5mol/L）和不同的pH值（3、3.5、4、4.5、5、9）对提取效率的影响。结果显示：乙酸铵缓冲体系提取结果相对干净；同一缓冲体系在同一pH值下，不同浓度的缓冲液对提取结果影响不大；pH是影响最大的因素，pH为4.5-5时最合适，其他范围MG均受到不同程度的破坏，特别是在pH=9的时候，MG基本破坏尽，上机几乎检测不到峰值。所以在参考国标的基础上选定0.1mol/L的乙酸铵（pH=4.5）作为提取缓冲液。

4.2 方法净化原理分析

水产样品分析过程中，主要干扰物是油脂和蛋白。本研究主要利用有机溶剂沉淀蛋白，C18散装填料近年来在国际多兽药残留检测中有比较广泛的应用，主要用于吸附油脂[4-5]。乙酸铵缓冲液作为离子对试剂，硫酸钠作为盐析试剂，二氯甲烷作为极性改进剂，改变乙腈的极性使其能与水层完全分离，而且乙腈与二氯甲烷的比例必须大于或等于2：1，否则乙腈层与水层无法完全分离，提取液中存在一定的水相，无法完全蒸干而且存在暴沸的风险。

4.3 试剂添加顺序的探讨

本研究在实施过程中，最佳的试剂添加顺序为：乙腈、0.1mol/L乙酸铵、C18，上清液转另一管后再加二氯甲烷。但对于像虾这种非常粘稠的样品，先用乙腈可能无法将其涡旋分散，因此可以先加0.1mol/L乙酸铵将其涡旋分散，再加乙腈，而C18必须在二者添加后才能加，否则会引起回收率偏低。其原因可能是一方面C18是一种非极性通用型吸附剂，对非极性物质具有比较好的吸附效果，MG类物质极性不大也可能被其吸附，另一方面MG类物质的PKa在6.5左右，在pH=4.5的乙酸铵缓冲液下，其已经充分离子化，从而不易被C18吸附，所以加入的顺序必须注意。另外，二氯甲烷的加入必须将上清倒入另一管后再加，如果在同一管内加入，鱼肉中的很多非极性物质会被萃取进来而带来很大干扰，还可能造成分层困难（易乳化）。

5 结论

本研究建立的方法与国标法相比，具有如下优点：处理步骤简单，检测速度快；有机溶剂用量少，总共只用了15mL有机溶剂；检测成本低，可只用C18散装填料，不必使用价格昂贵的固相萃取小柱，成本大概为2元/样品；检测结果准确、可靠，经过本实验室一年多来的实践应用，获得了比较理想的效果，值得推广和应用。

［1］庞国芳，等.农药兽药残留现代分析技术[M].北京：科学出版社，2007:488-489.

［2］GB/T 19857-2005 水产中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定[S].

［3］陈小华，汪群杰.固相萃取技术与应用[M].北京：科学出版社，2010:162.

［4］Waters Application Note.Optimized Extraction and Clear up Protocols for LC-MS/MS Multi-Residue Determination of Veterinary drugs in Edible Muscle Tissues.2011.

［5］S Lehotay.High-Throughput Screening Analysis by UPLC-MS/MS of 60 Veterinary Drugs in Animal Tissues[R].125thAOAC Annual Meeting Presentation 2303,21 September ,2011.