硝酸铋修饰碳纤维电极循环伏安法测定水样中的半胱氨酸

李 飞，朱永春，田 红，高 鹰

（沈阳师范大学 化学与生命科学学院，沈阳 110034）

0 引 言

半胱氨酸（Cysteine）是一种含有巯基的氨基酸，在生命体中的酶催化、蛋白质高级结构等方面起着关键性作用。在临床上，与同型半胱氨酸一样，半胱氨酸的浓度失调将导致心脑血管等疾病，被作为疾病的生物标记物。半胱氨酸通常的分析方法包括分光光度法、纸层析法、生物测定法、电化学检测法、氨基酸分析仪和高效液相色谱法等［1］。其中电化学检测方法的简单、快速、无毒、直接、成本低、灵敏度高和可用于活体检测等优势引起了广泛的关注［2－5］。利用半胱氨酸分子中巯基—（SH）能够与许多金属有很强的相互作用的特点，可以实现其在金属电极上的固相微萃取［6－7］，实现萃取和富集与分析一体化，提高电分析方法的灵敏度和选择性［8－9］。铋电极具有与汞电极相似的性质，常用于重金属的分析测定，利用铋与巯基的配位作用［10－11］。本文以碳纤维簇盘电极为基础电极，电化学沉积铋修饰电极，建立了半胱氨酸的固相微萃取和电化学检测新方法。

1 实验部分

1.1 仪器设备与试剂

仪器：CHI620b电化学分析仪（上海振华仪器公司），三电极体系（铂丝为对极，饱和甘汞电极为参考电极，碳纤维簇电极为基础工作电极。

试剂：分别用磷酸氢二钠，氢氧化钠，柠檬酸作为缓冲溶液，控制pH范围在3.0～10.6之间。硝酸钾配成0.5mol／L浓度的溶液，做为支持电解质溶液。硝酸铋配成1.0mmol／L浓度的溶液，做为电极的修饰溶液。半胱氨酸配成0.001mol／L的储备溶液，作为半胱氨酸的标准溶液，胱氨酸，白氨酸，牛血清白蛋分别配成0.001mol／L浓度的溶液，作为干扰实验的溶液。以上试剂均为分析纯，均购买与沈阳国药集团。实验所用废水取自沈阳师范大学校园的湖中，湖水煮沸十分钟杀灭微生物，在室温条件下用10000RPM离心机离心获得。

1.2 碳纤维电极的制备

将一簇直径约7μm的碳纤维以环氧树脂固化在内径约3mm玻璃管中，置于空气中放置晾干，一端在1 000目的金相砂纸和硫酸纸打磨抛光作为基础工作电极。

将基础工作电极置于0.001mol／L的Bi（NO3）3溶液中，以循环伏安的法将铋沉积到电极表面上，即获得铋修饰的碳纤微簇工作电极。

2 结果与讨论

2.1 半胱氨酸在铋修饰电极上的电化学行为

将铋修饰电极分别置于含有1.0×10－7M半胱氨酸的pH＝4.0的0.25M的硝酸钾电解质溶液中，在0.040V／s的扫速下进行循环伏安试验，获得的循环伏安曲线如图1所示。铋修饰电极在电解质溶液中，没有氧化还原峰（曲线1），而在含有半胱氨酸的溶液中于0.414V处出现一个不可逆氧化峰。属于半胱氨酸与铋形成络合物的氧化峰。

该峰随扫速的关系呈非线性关系，回归方程为

此结果表明，电极过程受到扩散和表面双重控制，即与表面上沉积的铋有关，又与溶液中半胱氨酸向电极表面上扩散有关。试验中选择扫描速度为0.04V／s。

图1 铋电极在含有（2）和不含有半胱氨酸的支持电解质溶液中循环伏安曲线

2.2 铋沉积量的影响

试验中以循环伏安法沉积铋，在给定铋盐浓度、扫速和电位范围下，铋的沉积量与扫描圈数呈正比。保持其他条件不变，改变扫描圈数，将获得不同铋沉积量的电极置于含有1.0×10－6mol／L半胱氨酸的电解质溶液中进行循环伏安试验，以获得的氧化峰电流对扫描圈数作图，如图2所示。

从图2可知，当扫描圈数为6圈时，L－半胱氨酸的氧化峰值最大，所以确定硝酸铋的最佳沉积圈数为6圈。

图2 氧化峰电流与循环伏安扫描圈数的关系

2.3 溶液pH的影响

半胱氨酸为三元弱酸，具有三级电离常数，其pKa分别为2.12，8.21，10.38［］。溶液pH 决定半胱氨酸分子的存在形式，是与铋原子相互作用的重要因素之一。通过磷酸缓冲体系控制溶液pH值在3.0～10.6范围内，在含有浓度为10－6mol／L的半胱氨酸溶液中进行循环伏安试验，将获得的氧化峰电流对溶液pH作图，如图3所示。

随溶液pH值的增加，氧化峰电流曲线变化，且分别在pH＝4.0和pH＝9.0处出现2个较大的峰，表明在此pH下，半胱氨酸的存在形式更有利于在铋电极表面上吸附富集，使得氧化峰电流出现极大值。考虑到在弱碱条件下，铋离子趋于形成氢氧化物沉淀而不利于半胱氨酸的吸附。因此，实验中选择pH＝4.0为最佳pH.

2.4 最佳静止时间

静止时间是指将铋修饰电极置于半胱氨酸的溶液中进行吸附富集，直到进行循环伏安扫描之前的时间间隔。在保持其他条件不变下，改变不同的静止时间进行循环伏安实验，将半胱氨酸溶液的氧化峰电流值对放置时间作图，静止时间为2s时，峰电流最大，表明半胱氨酸与铋电极表面作用较快，不需要等待时间即可完成吸附平衡。因此，实验上选择2s为最佳静止时间。

2.5 最佳放置时间

放置时间是指电极置于溶液中，施加初始电位所持续的时间。保持其他条件不变，在不同静止时间下进行循环伏安实验，将L－半胱氨酸的氧化峰电流值对放置时间作图，如图4所示。

半胱氨酸的氧化峰电流在放置时间为10s时最大，所以实验中选择放置时间为10s。

图3 氧化峰电流与溶液pH关系

2.6 半胱氨酸的标准工作曲线

在最佳条件下，对不同浓度的半胱氨酸溶液中进行循环伏安实验，将获得的循环伏安曲线中半胱氨酸氧化峰电流对浓度的对数作图，如图5所示。

半胱氨酸的氧化峰电流随浓度的增大呈现两段线性关系。在较低的半胱氨酸浓度范围内（1.0×10－16～1.0×10－10mol／L），氧化峰电流随浓度的增加而增大，表明半胱氨酸－铋络合物浓度随半胱氨酸浓度增加而增加，线性回归方程为

图4 氧化峰电流与放置时间关系

在半胱氨酸浓度范围为1.0×10－7～1.0×10－4mol／L范围内，氧化峰电流随半胱氨酸浓度的增加而降低，表明半胱氨酸在铋电极表面形成自组装膜，而降低了半胱氨酸－铋络合物的氧化还原活性，导致电流下降。其回归方程为

在最佳条件下，进行了10次检测实验。平均氧化峰值电流为1.797 7±0.119 2μA，相对标准偏差为6.6%。

图5 峰电流与浓度的对数关系

2.7 干扰实验

在相同优化实验条件下，在含有1.0×10－13mol／L半胱氨酸溶液中加入等浓度的白氨酸、胱氨酸、蛋白质，进行的干扰实验。改变比率，发现100倍的3种物质均不影响半胱氨酸的检测如表1所示。

表1 不同摩尔比下的共存物质下测定半胱氨酸的相对误差 %

2.8 实际水样的检测

将沈阳师范大学校园湖水煮沸约10min，以杀死微生物，在室温和10000RPM离心机离心。取湖水样品溶液5.0mL，5.0mL缓冲液（pH 值4.0），5.0mL 0.5M 硝酸钾。进行了10次重复实验，平均电流2.683μA，由标准曲线计算得湖水中的半胱氨酸浓度估计为6.22μm。

3 结 论

综上所述，循环伏安法研究了铋修饰碳纤维簇电极上半胱氨酸的吸附萃取和电化学行为，并应用于半胱氨酸的检测，获得以下结论：

1）循环伏安法在碳纤维簇电极表面上沉积铋粒子，实现了碳纤维电极的铋修饰，为半胱氨酸的固相微萃取奠定基础；

2）在最佳条件下，循环伏安法监测了半胱氨酸的电化学行为及其固相微萃取的动力学和热力学过程，建立了半胱氨酸的电化学检测方法；

3）半胱氨酸的固相微萃取电化学检测具有较高的灵敏度和选择性，共存的白氨酸，胱氨酸和蛋白质不干扰检测，用于污水中半胱氨酸的分析，结果令人满意。

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