一种纳豆芽孢杆菌的分子鉴定及纳豆激酶基因克隆

李建强，石洪凌，肖冬光

（1.天津科技大学 生物工程学院，天津 300000；2.唐山师范学院 生命科学系，河北 唐山 063000）

纳豆激酶（Nattokinase，NK），也称Subtilisin是由纳豆芽孢杆菌（Bacillus sbtilis natto）产生的一种具有溶栓功能的碱性丝氨酸蛋白酶。是由日本的须见洋行等于 1987年首次在日本传统食品纳豆中发现提取出来并定名[1]。纳豆激酶在体内外都具有明显的溶栓活性。与现有的溶栓剂相比，主要表现在可以口服、半衰期长（2-8 h）、抗原性弱、毒副作用小，药源广泛，在胃肠道pH环境中仍能保持活性，既直接作用于纤维蛋白，溶解血栓的主要成分纤维蛋白，又可间接激活体内的纤溶酶原，从而使其成为目前发现的100多种具有口服纤溶作用的物质中最具潜力的纤溶蛋白酶[2]。

目前，国内外对纳豆激酶的研究主要集中在以下几个方面：通过改良菌种和优化纳豆生产工艺等方法来提高纳豆中纳豆激酶活性[3,4]；对纳豆芽孢杆菌液体发酵条件优化，纳豆激酶的提取纯化等方面的研究[5,6]；纳豆激酶的克隆及其在不同载体中表达的研究[7]。其中获得高产菌株是纳豆激酶生产的关键。

本研究对一株从腐烂叶片表面分离得到的具有溶血活性的芽孢杆菌进行了鉴定。再根据已知纳豆激酶序列设计引物，克隆纳豆激酶基因。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒

芽孢杆菌为本课题组在腐烂叶片表面分离纯化并保存（LJQ-NK），纤维素平板实验表明该菌有水解纤维素的作用。质粒pUC19，E.coli JM109购自TaKaRa公司。

1.1.2 培养基

大肠杆菌培养基：LB，SOB[8]。

纳豆芽孢杆菌培养基：牛肉膏5 g、酵母抽提物5 g、葡萄糖5 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g溶于800 mL水中，pH 7.0，定容至1 L，灭菌20 min后备用。

1.1.3 试剂

Taq酶、DNA Marker均购自TaKaRa公司。DNA胶回收试剂盒（Axygen-AP-GX-50）为Axygen公司产品。

1.1.4 引物设计与合成

根据NCBI已经发表的纳豆芽孢杆菌16S rRNA和纳豆激酶基因序列。利用Primer 5软件对基因序列分析，设计引物（由上海生工生物有限公司合成）如表1所示。

表1 PCR引物列表

1.2 试验方法

1.2.1 基因组DNA的提取

取37 ℃过夜培养物1 ml，5 000 rpm离心10 min，去上清液。沉淀的菌体用无菌水清洗三次。加入800 μl CTAB提取缓冲液，混匀（CTAB在65 ℃水浴预热），每5 min轻轻震荡几次，20 min后12 000 rpm，离心15 min；小心吸取上清液，加入等体积的酚；氯仿（各400 μl）溶液，混匀，4 ℃，12 000 rpm，离心10 min；加入等体积的氯仿，混匀，4 ℃，12 000 rpm，离心10 min；取上清液，加1倍体积异丙醇，-20 ℃沉淀20 min；4 ℃，12 000 rpm，离心10 min；弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀2次；室温下干燥后，溶于50 μl去离子水中，于-20 ℃下保存备用。基因组提取结果应用1%琼脂糖电泳检测。

1.2.2 目的基因片段的PCR扩增

以基因组 DNA为模板分别应用表一中的引物进行PCR 扩增，循环参数为94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，28 个循环；72 ℃，5 min。

1.2.3 PCR产物的纯化和测序

PCR产物经1%的琼脂糖电泳后，用Axygen胶回收试剂盒回收目的PCR产物。然后与pUC19质粒链接，转入大肠杆菌JM109，挑取白斑，37 ℃培养过夜，抽提质粒，电泳检测后交予上海生工生物公司进行核酸序列测定。

1.2.4 序列同源性分析

利用美国国家生物技术信息中心（NCBI）网站的Nucleotide-nucleotide BLAST（blastn）程序，提交测序得到序列，同时应用DNAMAN软件分析16S rRNA和NK序列与已报道序列的同源性。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA提取结果

应用CTAB法提取芽孢杆菌的基因组DNA，结果如图1所示。所得到的DNA分子量远大于10 kb，而且电泳条带单一，无明显降解。可以用于进一步的实验。进一步说明CTAB法可以用于枯草芽孢杆菌的基因组DNA的提取。

图1 基因组DNA电泳结果

2.2 PCR扩增结果

以基因组DNA为模板，分别用表1中的引物扩增得到相应的片段，琼脂糖电泳鉴定PCR产物，分别在1.0 kb和1.2 kb附近有十分明显的DNA扩增带。与预期的片段长度相吻合（图2）。

图2 琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物

2.3 16S rRNA 序列测定及分析结果

所得DNA序列长度为896 bp。将该16S rRNA序列递交GenBank通过Blast进行同源序列检索，结果发现，一共119个亲缘关系相近的序列全部为枯草芽孢杆菌，其中同源性最高的前三个菌株，LJQ-NK与它们都具有99.9%以上的同源性。结果表明LJQ-NK可能为一株枯草芽孢杆菌。

2.4 纳豆激酶基因克隆

图3 LJQ-NK菌种的纳豆激酶序列和已知的纳豆激酶（GI 29164926）序列比较结果

为进一步验证LJQ-NK的溶血栓能力是否来自于产生纳豆激酶，根据已报道的纳豆激酶序列的全长设计引物，克隆纳豆激酶基因。经电泳分析，通过PCR扩增得到长度为 1 120 bp的 DNA片段，进一步测序分析，结果表明LJQ-NK中纳豆激酶序列与已报道的纳豆激酶序列只有两个碱基序列存在差异，分别为18和1 117。而编码纳豆激酶开放阅读框的碱基序列完全相同，结果如图3所示。结果表明LJQ-NK菌种拥有溶解血栓能力可能是因为该菌种能分泌纳豆激酶所致。

3 讨论

随着分子生物学的发展基于16S rRNA具有功能和进化上的同源性，以及它们序列进化变异频率缓慢，在整体结构上极端保守并且分子大小适中，携带有充分的生物信息，可用来进行可靠的系统进化分析等特征，结合PCR扩增技术，建立了通过比较16S rRNA 全部核苷酸序列来确定生物分类地位的方法。该方法具有方便快捷等优点，同时可以从分子的角度来描述不同菌株种内之间的差异，是目前在细菌的系统分类学研究中最有用的和最常用的方法，对确定新种有重要的作用[9]。本研究根据已报道的纳豆芽孢杆菌的16S rRNA序列设计引物，克隆得到LJQ-NK菌的片段，通过同源性比对分析，初步鉴定LJQ-NK可能为纳豆芽孢杆菌。

1992年，Nakamura等利用鸟枪法首次得到了纳豆激酶基因序列信息并进行了分析[10]。该基因长1 473 bp，起始密码子是GTG，纳豆激酶的转录调控区域即位于起始密码子的上游17 bp-11 bp处，该位点是核糖体结合位点SD序列（AAAGGAG）。终止序列为三个连续的终止密码子TAA、TAG、TAA，此段终止序列为ρ因子非依赖性终止序列。中间为381个氨基酸组成的阅读框架，包括29个氨基酸的信号肽，77个氨基酸残基的前导肽和275个成熟氨基酸单链肽。本研究克隆得到长度为1 120 bp的片段，通过序列分析，与已报道的纳豆激酶序列有两个碱基不同，编码开放阅读框的序列完全相同。结果可以说明，LJQ-NK菌株的溶血栓能力，可能与产生纳豆激酶有关。

[1] Sumi H., Hamada H., Tsushima H., Mihara H., Muraki H.A novel fibrinolytieal enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese natto a typical and popular soybean food in the Japanese diet[J].Experientia, 1987, 43(10): 1110-1111.

[2] Sumi H., Hamada H., Nakanishi K., Hiratani H.Enhancement of the fibrinolytic activity in plasma by oral administration of nattokinase[J].Acta Haematologica, 1990,84(3), 139-143.

[3] 奚晓琦,王加启,卜登攀,孙妍,周凌云,魏宏阳.纳豆芽孢杆菌的分离鉴定及纳豆激酶高产菌株的筛选[J].东北农业大学学报,2009,40(11):69-75.

[4] Ko J.H., Yan J.P., Zhu L., Qi Y.P.Identification of two novel fibrinolytic enzymes from Bacillus subtilis QK02[J].Comparative Biochemistry and Physiology Part C,2004, 137: 65-74.

[5] 曹新界,朱龙宝,陶玉贵.纳豆菌分批发酵纳豆激酶动力学研究[J].食品科技,2012,37(8):36-39.

[6] Cho Y.H., Song J.Y., Kim K.M., Kim M.K., Lee I.Y.,Kim S.B., Kim H.S., Han N.S., Lee B.H., Kim B.S.Production of natto kinase by batch and fed-batch culture of Bacillus subtilis[J].New Biotechnology, 2010, 27(4):341-346.

[7] 敬俊峰,陈斌,李莹,何正波,霍金柱.纳豆激酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达[J].生物学杂志,2011,28(5):55-59.

[8] 黄培堂,等译.萨姆布鲁克,拉塞尔.分子克隆实验指南(第三版)[M].北京:科学出版社,2008.

[9] 刘朝军,沈定霞,16SrDNA 序列测定在细菌鉴定中的应用[J].军医进修学院学报,2011,32(7):774-776.

[10] Nakamura T., Yamagata Y., Ichishima E.Nucleotide sequence of the subtilisin NAT, aprN, of Bacillus subtilis(natto)[J].Biosci.Biotechnol.Biochem., 1992, 56:1869-1871.