复方扶芳藤合剂中重金属元素测定及其安全性评价

梁晓艳，唐秀能，胡军高，王 晶，梁旭霞*

(1.广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530011;2.广东省疾病预防控制中心，广东 广州 510300)

复方扶芳藤合剂(原名百年乐)是我国老中医发掘的隋朝宫廷秘方，以祖国医学理论为依据，历经30年的临床实践，有延年益寿、补血养颜、善治未病、补气益血、安神补脑的功效。本品由扶芳藤、黄芪、人参等中药组成，含有黄酮、生物碱、酚类化合物、叶绿素衍生物、胡萝卜素等活性成分［1］。实验研究证明本品有延长实验动物平均寿命、增加心肺血流量、对抗血栓形成、改善微循环、增加血红蛋白量、提高机体免疫功能、清除自由基、增强SOD活性等作用［2-6］。百年乐牌复方扶芳藤合剂以其确切、神奇的疗效、可靠的质量获得了权威认可，从2000年起至2010年均被载入《中国药典》目录，成为国家中药保护品种和国家基本药物［7］。

中药中的重金属限量在国内外备受关注［8-9］，因为重金属对人体健康潜在危害不容忽视。美国药典委员会(USP)于2009年4月发布了新文件《无机杂质:重金属控制专论》，对重金属杂质的控制给出了详细的规定和要求［10］。复方扶芳藤合剂系国家中药保护品种和国家基本药物，已从毒理学［11］、药效学［2-6］和质量控制学［1］等多方面实验研究与报道证明其是安全有效的，但对其重金属的安全性评价目前尚未见报道，这对于长期服用的复方扶芳藤合剂尤显重要。

本实验采用电感耦合等离子体质谱技术对百年乐牌复方扶芳藤合剂中14种重金属元素进行测定，并对其服用安全性进行评估。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验仪器 电感耦合等离子体质谱仪Agilent 7700X ICP-MS(Agilent Technologies Co.Ltd，USA)，micromist雾化器，镍采样锥和截取锥;自动进样装置(CETAC Technologies，USA);Chemstation工作软件(Agilent Technologies Co.Ltd，USA);超纯水处理系统(Milli-Q Plus Academic，USA);纯度＞99.999%氩气(广州气体厂);10、20、50、100、200μL 精密微量移液器(Eppendorf，Germany);AG204电子天平(SNR:1119030718.METTLER TOLEDO，Switzerland);高压密闭微波消解系统(Bergh of Speed Wave MWS-3，Germany);电热板，80～240℃温度可调。

1.1.2 试药与试剂

1.1.2.1 试药 复方扶芳藤合剂(每支15 mL)6批，批号分别为20110306、20110811、20111002、20120205、20120913、20121118，广西中医药大学制药厂生产。

1.1.2.2 试剂 硝酸(GR，Merck，Germany);超纯水(电阻率≥18.2 MΩ·cm)。

1.1.2.3 有证参考物质及标准溶液

有证参考物质:茶叶(Tea leaves)，INCTTL-1，波兰核化学与技术研究所(Institute of Nuclear Chemistry and Technology，Poland);冻干榉木叶粉(Lyophilised beech leave powder)，BCR-100，欧洲委员会测试联合研究中心标准物质研究所(Institute for Reference Materials and Measurements of European commission Joint Research Centre)。

多元素标准溶液:铁(Fe)(1.0 mg/mL)、铬(Cr)、锰(Mn)、镍(Ni)、铜(Cu)、锌(Zn)、砷(As)、银(Ag)、镉(Cd)、锑(Sb)、钡(Ba)、铊(Tl)、铅(Pb) (10.0μg/mL)(5183-4682，Agilent Technologies Co.Ltd，USA);单元素标准溶液，锡(Sn) (500μg/mL，20%HCl)［GSB G 62042-90(5001)］(国家钢铁研究院);内标溶液，钪(Sc)、锗(Ge)、钇(Y)、铟(In)、铽(Tb)、铋(Bi)(10μg/mL)(5183-4680，Agilent Technologies Co.Ltd，USA);质谱调谐液，锂(Li)、钇(Y)、铈(Ce)、铊(Tl)、钴(Co)(10 ng/mL)(5184-3566，Agilent Technologies Co.Ltd，USA)。

1.2 方法

1.2.1 样品称量 取本品6批，准确称取0.8 g(精确至0.001 g)至微波消解专用聚四氟乙烯内罐中，备用。同时准确称取有证参考物质0.2 g，备用。一式3份。

1.2.2 样品消解及样品溶液配制

1.2.2.1 微波消解 已称量样品中加入5 mL浓硝酸，加盖于电热板上120℃预消化1 h，然后密封消化罐，置入微波消解炉，程序升温至180℃保持15 min，冷却后取出，消解样品溶液清澈透明呈黄绿色［12］，少量水冲洗内盖，消解罐置于电热板上140℃赶酸至约0.5 mL。

1.2.2.2 样品溶液配制 用2%HNO3将消解液转移入15 mL BD塑料试管，并定重至10.0 g，摇匀，待测。

1.2.3 标准溶液配制

1.2.3.1 多元素标准溶液配制 吸取多元素标准溶液，用2%HNO3将多元素混合标准溶液稀释成系列标准溶液，质量浓度如下，Fe为0.00、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00μg/mL;Cr、Mn、Ni、Cu、Zn、As、Ag、Cd、Sb、Ba、Tl、Pb 为 0.00、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00 ng/mL。

1.2.3.2 单元素标准溶液配制 吸取单元素Sn标准溶液适量，用2%HNO3稀释成质量浓度分别为0.00、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 ng/mL 的系列标准溶液。

1.2.3.3 在线内标溶液配制 将10μg/mL的Sc、Ge、Y、In、Tb、Bi元素，使用前，用 2%HNO3稀释为1.0μg/mL溶液。

1.2.3.4 质谱调谐液 将10 ng/mL Li、Y、Ce、Ti、Co元素，使用前，用 2%HNO3稀释为 1 ng/mL的溶液。

1.2.4 ICP-MS实验条件 ICP-MS实验条件见表1，在仪器调谐达到较佳状态时，依次将试剂空白、标准系列、质控样品、样品溶液引入仪器进行检测，由工作站软件采集数据并计算结果。

1.2.5 分析方法技术参数验证

1.2.5.1 检出限与定量限测定 同时制备空白消解溶液20份，测定所需检测金属元素，依据2010年版中国药典［7］及食品卫生检验方法(理化部分)注解［13］有关规定，计算检出限与定量限。

1.2.5.2 标准工作曲线制定 测定配制好的系列浓度梯度标准溶液，以各元素与相应内标元素的CPS(counts per second)计数率为纵坐标、溶液浓度为横坐标制作标准工作曲线。

表1 ICP-MS仪器操作条件及参数Tab.1 Operation conditions and parameters of ICP-MS

1.2.5.3 样品回收率测定 平行准确称取复方扶芳藤合剂(20110811)样品9份各0.8 g，备用。依据该样品测试得到的各元素本底水平，分别在上述样品中加入各单元素标准溶液适量，使其在定重至10.0 g后的溶液中各加标元素浓度分别约为本底值的0.5倍、1倍、2倍三个浓度水平，每个加标浓度对应3份平行样。微波消解，定重至10.0 g。依照本法测定金属元素量并计算回收率。

1.2.5.4 精密度测定 测定上述不同浓度加标样品的金属量，计算方法精密度(n=3)。

1.2.5.5 分析方法验证 平行制备3份榉木及3份茶叶参考物质，计算平均值与相对标准偏差，比较各元素的平均值与参考物质参考值，结合相对标准偏差，分析本方法的准确性与精确度。

1.2.5.6 方法稳定性试验 将制备好的复方扶芳藤合剂(20110306)样品消解溶液，分别于1 h、6 h、22 h测定3次;放置一个月，分别在第8天、第15天、第29天用相同测试条件测定;分别计算平均值与相对标准偏差，考察方法稳定性。

1.2.6 样品检测 根据建立好的分析方法和标准工作曲线，测定上述空白溶液、样品溶液和有证参考物质溶液中各金属元素。

1.2.7 数据处理 由仪器工作站Chemstation软件绘制标准曲线，并根据标准曲线回归方程y=ax+b，自动计算出样品中测定元素的浓度。检出限、精密度、回收率计算依据文献［13］所给方法进行计算。

2 结果

2.1 检测方法参数

2.1.1 检出限与线性范围 以称样量0.5 g，定重10.0 g计算各金属元素检出限、定量限和相关系数，见表2，可看出，所测元素检出限低，方法灵敏，各元素相关系数均大于0.9995。

表2 方法检出限与线性范围(n=20)Tab.2 Detection limits and linear ranges of the method

2.1.2 加样回收率试验 各元素在本底值的0.5倍、1倍、2倍三个浓度水平加标试验，回收率测定结果在79.0% ～110.4%之间，见表3。

表3 加料回收率(n=3，μg·L－1)Tab.3 Results of recovery tests(n=3，μg·L－1)

2.1.3 精密度 本方法精密度在1.8% ～12.4%之间。样品本底值测定RSD最大为Ag 12.4%，其检测浓度在检出限附近;低浓度添加水平RSD最大为Ag 10.8%;中浓度和高浓度添加水平RSD最大值分别为Cd 7.3%、Sb 6.9%，其含量均在超痕量分析水平。其他元素精密度均小于10%。

2.1.4 有证参考物质 BCR-100及INCT-TL-1检测结果准确，当所测金属元素含有量100 mg/kg时，回收率在97.9% ～102.0%，含有量在1～100 mg/kg间回收率在91.6% ～103.9%，含有量在0.1～1 mg/kg间回收率在96.2% ～105.9%，含有量小于0.1 mg/kg时，回收率在95.2%～109.5%，相对标准偏差小于15%，结果见表4。

表4 有证参考物质分析结果(n=3)Tab.4 Analysis results of certified reference materials(n=3)

2.1.5 稳定性试验 日内误差与日间误差分析显示，相对标准偏差在0.3% ～5.2%之间，检测结果误差小，方法稳定。

2.2 样品检测结果 上述分析方法的检出限、线性范围、相关系数、精密度、加样回收率、标准物质测定结果准确性和稳定性完全满足欧盟委员会决议授权文件EN 2002/657/EC《贯彻执行96/23/EC关于分析方法和结果解释的决议》分析要求［14］。采用该方法对批号为 20110306、20110811、20111002、20120205、20120913、20121118的6批复方扶芳藤合剂常见金属元素进行分析，分析结果见表5。6批样品中所有元素含有量及其平均含有量均小于USP规定的口服限量或中药食品限量，铬、铜、银、镉、锑、钡和铅同时小于生活饮用水限量，见表6。

表5 6批样品14种金属元素的分析结果(n=3)Tab.5 Contents of 14 metals in 6 batches of samples(n=3)

表6 样品中14种金属的平均含有量与相关标准限量比较Tab.6 Comparision of 14 metal average contents in the samples with related standard limits

2.3 各重金属日暴露剂量 复方扶芳藤合剂说明书中服用量为每次1支，每日两次，即每日服用30 mL(约30g)，按照此服用量计算摄入本药品的重金属日暴露量，与美国USP规定的口服制剂中的PDE(允许日暴露剂量)［10］比较，得出安全边际系数MOS(Margins of safety)。MOS≥1，该物质对摄入的安全风险是可以接受的;MOS＜1，该物质对安全影响的风险超过了可以接受的限度，应当采取适当的风险管理措施。结果见表7。砷的MOS系数最小，等于10;铊次之，等于27，其他元素大于66。所有元素MOS系数均远远大于1，有很高的安全边界值。

表7 复方扶芳藤合剂重金属日暴露量及MOS值Tab.7 Daily exposure of 14 heavy metals and MOS in Compound Fufangteng Mixture

3 讨论

3.1 重金属元素的危害特征描述 重金属进入人体后不易排出，在人体内蓄积会导致一系列的急、慢性疾病。我国环境重金属污染日益加重，人体对重金属的暴露也日益增加。中药材中的重金属进入人体后与体内有机成分结合成金属配合物或金属螯合物。机体内很多重要物质如蛋白质(氨基酸)、核酸等都可以与重金属离子发生反应，从而造成人体的多脏器损害、致畸变、致癌等［17-18］。

铅主要损害神经系统、造血器官和肾脏。小儿出现发育迟缓、听觉障碍、注意力不集中、智力低下等现象。慢性铅中毒，病情严重者可导致中毒性肾病、急性肾功能衰竭、铅毒性脑病、铅毒性瘫痪等。鉴于铅导致儿童智力损害和成人血压升高，2011年联合国粮农组织、世界卫生组织联合食品添加剂专家委员会(JECFA)取消了铅的暂定每周耐受摄入量(Provisional Tolerable Weekly Intake，PTWI)，认为无法设置安全限值，铅摄入量应尽可能低［19］。

镉在人体肾脏半减期长达10～33年，在肝脏半减期为4～19年。其不仅损害肾脏和骨骼，对生殖系统、心血管系统、神经系统、免疫系统均有毒害作用，还可引发乳腺癌、肺癌等癌症，国际抗癌联盟将其定为IA级致癌物。世界卫生组织建议每人每日摄入镉的量应为0或很小。出于镉危害大及半减期很长之考虑，2011年JECFA将镉的PTWI值7μg/kg·bw改为PTMI(暂定每月耐受摄入量)并调低数值，暂定为 25μg/kg·bw［19］。

砷对各种生物均具有急、慢毒性作用。它对200多种酶的活力具有抑制作用，通过干扰酶的功能和转录调控，对多个系统的功能产生影响。砷化物可引起乌脚病、糖尿病、高血压、外周神经病和多种血管疾病，还可引起贫血、肝脏损伤、肝硬化、造血抑制、缺水性血症、感觉紊乱和体质量减轻［20］。

铊是一种毒性很高的重金属元素，且具有强蓄积性，其毒性远远高于砷化物，主要表现为神经毒性，并引起肾脏、肝脏等多脏器损害。动植物对铊具有相当强的富集作用［21］。

铬元素有多种氧化态，三价铬是机体蛋白质、脂类和碳水化合物正常代谢所必需的元素，但六价铬为剧毒致癌物质，如果人慢性暴露会发生肾损害、贫血、大出血、肝损害、骨质疾病等，极易发生癌症，六价铬还会进入 DNA遗传给下一代［22］。

钡为人体非必需金属元素，天然存在于地壳和地表水中，饮食是普通人群钡暴露的最主要途径。摄入过量可溶性钡化合物可引起胃肠炎、低钾血症等［23］。

锑是一种有毒微量元素。锑与细胞中的巯基进行不可逆转的结合，进而干扰含巯基蛋白质和酶类的正常代谢，从而对生物体产生毒害，可引起肺脏、心脏、肝脏、皮肤黏膜和血液系统等多器官损害。锑对人体具有潜在的致癌风险，也可能具有基因毒性。鉴于锑的毒性，WHO规定，锑的人体每日允许摄入量(ADI值)为0.86μg/kg·bw，而每人每天可以忍受的锑摄入量(TDI值)为6μg/kg·bw［24］。

无机锡在自然界中属于低毒类物质。锡过量会使肝脏变性、肾小管变化以及缩短动物的寿命。无机锡化物主要引起生长受阻、睾丸退化和大脑白质改变等疾病。有机锡化合物多数有害，属神经毒性物质，特别是三乙基锡，它们主要抑制神经系统的氧化磷酸化过程，从而损害中枢神经系统。锡能影响人体对锌、铁、铜、硒等元素的吸收等，降低血液中钾离子等的浓度而导致心律失常等疾病［25］。

镍存在于植物和微生物体内许多酶中，在人体内，镍影响铁的吸收和代谢，可能是造血过程中一个必要的成分。有证据证明吸入镍盐可使啮齿类动物和人致癌，但缺乏经口摄入镍盐致癌的证据。对镍敏感的人群，从膳食中摄入镍150μg/人/日即可引发手部湿疹，仅相当于所报道最低摄入量(490μg/人/日)的 1/3［26］。

铜参与几十种酶的组成和活化，影响本体的生物转化、电子传递、氧化还、组织呼吸等，对于结缔组织的形成、神经系统的发育以及骨骼的发育都是十分必要的，铜也参与铁和能量的代谢。但是较高浓度的铜在人体内蓄积，具有溶血作用，能引起肝、肾良性坏死［27］。

锌与大约100多种酶的活性有关，与DNA的锌指结构也有关。锌缺乏会影响免疫系统功能、伤口愈合、味觉和嗅觉以及损失的DNA合成等。但是如果摄入过量锌(150 mg/L～450 mg/L)会引起低铜水平，影响铁的功能，降低免疫力，并且降低高密度脂蛋白(HDL)水平。英国给出的参考营养摄入量(Reference Nutrient Intake，RNI)为男5.5 ～9.5 mg/日，女 4.0 ～7.0 mg/日［28］。

锰是人体必需的微量元素，参与许多酶的合成与激活，参与人体糖、脂肪代谢，加快蛋白质、维生素B合成，催化造血机能，调节内分泌，提高免疫功能。锰缺乏可引起侏儒症、贫血、支气管哮喘、帕金森病、儿童智力低下、肿瘤等。锰摄入过多引起急性中毒主要表现为急性腐蚀性胃肠炎或刺激性支气管炎、肺炎;慢性锰中毒主要表现为锥体外系神经系统症状，并且有神经行为功能障碍和精神失常［29］。

铁是人体必须的微量元素之一，有重要的生物学功能。铁含有量过高或过低都将影响机体的生物学活性。研究证实过量铁具有更显著的毒性效应。与铁过载相关的疾病广泛涉及内分泌系统、消化系统、心血管系统、呼吸系统、神经系统、骨与关节系统、感染、肿瘤等诸多方面，因此必须严格控制铁摄入水平［30］。

3.2 复方扶芳藤合剂重金属摄入安全性评价 各批次样品之间，各种重金属量存在一定差异，其中锌含有量变异系数最大，69.9%，铁次之，58.1%，铊最小，14.4%，其他元素含有量变异在30%～50%之间。这可能与植物原料来源有关，产地、栽培、生长期、采摘季节等因素均会影响植物中元素含量［31］。

本品检出痕量铊，这与铊广泛分散于地球环境中，且在植物中具有强富集的特性有关［21］。本品锌含有量相对较高，日摄入锌量约为0.155 mg，占营养参考值(RNI)的3%左右，能够补充人体对锌的一些日常需求。

本品所测定的14种重金属元素量均很低，MOS值大于或等于10，其中毒性较大的重金属铅、镉、锑、铬、银、锡均未检出，砷、钡、铊检出量也很低，说明本产品在原料选择和生产过程中质量控制良好。本品在重金属摄入方面服用安全性高。

4 结论

本实验对广西中医药大学制药厂的国家级中药保护产品复方扶芳藤合剂(原名百年乐)的重金属进行了检测分析并对其重金属摄入安全性进行了初步评价，重金属含有量符合中国与美国的相关标准限量要求，14种重金属元素日均摄入量远低于美国USP和中国药典规定的重金属及有害元素允许日暴露剂量，安全边际系数远大于1，在重金属摄入方面其长期服用安全性是有保障的。

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