不同低氧训练模式对肌卫星细胞NO/HGF/c-Met激活通路的影响

黄 丹，孟 艳，翁锡全，林文弢

(1.佛山科学技术学院，广东 佛山528000;2.广州体育学院，广东广州510500)

以往的研究结果显示［1，2］，高原训练提高有氧耐力的同时也出现骨骼肌蛋白丢失、肌纤维横径缩小、肌肉萎缩以及肌细胞凋亡加剧等现象而影响大强度运动能力的发挥。正是出于高原训练对大强度运动能力不利影响的考虑以及人工低氧技术成熟应用，运动训练专家对传统高原训练方法进行了改进，陆续提出了间歇性低氧训练(IHT)、高住低练(Hi-Lo)、低住高练(LoHi)和高住高训低练(HiHiLo)等低氧训练模式［3，4］，但对于不同低氧训练模式对骨骼肌蛋白影响及其机制仍在探讨中，已有研究者从激素水平、生长因子等不同层面的变化探讨不同低氧训练对骨骼肌蛋白质合成作用的影响［5－7］，而骨骼肌蛋白质合成与卫星细胞的激活、增殖有关，NO/HGF/c-Met是肌卫星细胞激活主要信号通路之一［8］，目前从这一角度分析不同低氧训练模式对肌蛋白质影响还鲜见报道。因此，本文以SD大鼠为研究对象观察4周不同低氧训练模式对骨骼肌蛋白含量及肌卫星细胞NO/HGF/c-Met激活信号通路的影响，探讨低氧训练对骨骼肌质量的影响机制，为科学选择低氧训练模式提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与低氧训练方案

本实验动物来源、分组和低氧训练方案与黄森等报道为同一模型［9］，具体分组为低住安静组(LC)、低住低练组(LL)、高住安静组(HC)、高住低练组(HL)和高住高训低练组(HHL)，每组10只，以上实验干预为4周。

1.2 样品采集与处理

各组大鼠在最后一次干预后24小时麻醉解剖，取股四头肌，用干净滤纸将其吸干，并用锡纸包裹后立即用液氮速冻后，转入－80℃冰箱中保存。测试前用精密天平称取其200mg放入5mL烧杯内，按照1:9的比例加入预冷生理盐水置匀浆机上冰浴匀浆，直至肉眼无可视悬浮物。将匀浆液倒入试管，静置10min，在4℃以下以2 000 r/min离心10 min，取上清液测试相关指标。

1.3 指标测试及方法

采用考马斯亮蓝方法测试股四头肌中蛋白质含量，一氧化氮(NO)采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒，以S22PC分光光度计测试;利用RT－2100型多功能酶标仪测试股四头肌肝细胞生长因子(HGF)、肝细胞因子受体蛋白(c-Met)、促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)的含量，试剂盒均由美国ADL公司提供，所有测试指标的操作步骤严格按试剂盒要求进行。

1.4 数理统计法

运用肖维勒准则对原始数据进行异常数值筛选。各数据均用平均数±标准差来表示，并利用SPSS13.0软件进行One-way ANOVA分析，差异显著性标准为P＜0.05，极显著性水平为P＜0.01。

2 研究结果

2.1 不同低氧训练模式大鼠股四头肌蛋白含量的变化

表1可知，四周低氧训练干预后，HHL组股四头肌蛋白含量最低，且显著性低于其他4组(P＜0.05)，而其他4组间没有显著性差异(P＞0.05)。

2.2 不同低氧训练模式大鼠股四头肌NO/HGF/c-Met信号表达的变化

四周低氧训练干预后，从骨骼肌卫星细胞关键激活信号因子NO的变化发现，HHL组含量最高，并显著性高于LC、LL组(P＜0.05);而各组大鼠股四头肌中HGF、c-Met含量差异不显著(P＞0.05)，但HHL组股四头肌中的HGF含量相对较低;另外，HHL组骨骼肌MAPK水平最低，并显著性或极显著性低于LC组、LL组及HC组(P＜0.05，P＜0.01)，HL组也显著性低于LL组(P＜0.05)。

表1 各组大鼠股四头肌蛋白、NO、HGH、c-Met及MAPK比较

3 分析与讨论

3.1 不同低氧训练模式对骨骼肌蛋白含量的影响

蛋白质是骨骼肌重要组成成分，其代谢变化直接影响骨骼肌收缩及力量、速度素质。近些年国内外研究报道［10－12］，大多数研究者认为低氧运动可导致骨骼肌蛋白质丢失抑制蛋白质的合成代谢，并提出其主要原因运动训练及低氧干预加强了机体的缺氧应激，易造成肌肉血流量减少，蛋白质的翻译环节出现抑制，而导致其合成代谢降低，引起肌纤维变细甚至萎缩，从而导致肌肉力量丢失。

本实验结果显示，LL组大鼠肌蛋白含量上升，说明一定强度的耐力运动可促进蛋白质的合成代谢增加，而在此强度基础上实施低氧暴露，肌蛋白含量出现下降趋势。保留相同低氧刺激方式，改变运动模式时发现采用HHL进行训练时，大鼠骨骼肌蛋白质含量出现显著下降，由此现象进一步证实运动后低氧暴露更加剧了骨骼肌的缺血、缺氧状态，从而抑制骨骼肌蛋白质的合成代谢。

3.2 不同低氧训练对肌卫星细胞NO/HGF/c-Met激活通路的影响

骨骼肌的增生肥大依赖于肌肉蛋白质合成大于分解的净增加，然而肌蛋白质合成增加，肌纤维增粗与骨骼肌卫星细胞的激活、分化、融合和成熟等过程密切相关，然而肌卫星细胞的激活过程受多种信号分子调控。目前研究认为NO、HGF介导的信号级联对卫星细胞激活起到主要调控作用［13］。本实验也针对骨骼肌卫星细胞NO/HGF/c-Met激活通路探讨不同低氧训练模式对其的影响，以分析其影响骨骼肌蛋白质合成代谢的机制。

NO被认为是激活卫星细胞的信号分子。有研究表明运动训练、负重、损伤、剪切应力或机械达拉的刺激下，使NOS活性或含量提高，促进NO的释放，进而激活鸟苷酸环化酶，催化产生环磷酸鸟苷(cGMP)，而激活MAPK信号分子［14］;或NO可引发肌纤维快速释放HGF，通过HGF信号级联进而激活卫星细胞［15］。目前，有研究表明［16］短期低氧暴露可使血清中NO上升，并认为由于机体代偿能力增强所致，以适应突发的高原或低氧环境的应激;也有研究者［17］针对不同低氧训练对大鼠骨骼肌NOS系统影响的探讨，发现6周的高住高练骨骼肌nNOS mRNA表达升高234%，从而增加骨骼肌NO的含量，有助于毛细血管的舒张。本实验研究结果发现，低氧环境中NO含量均出现上升，其中HHL组显著升高。多数研究证实［13，14］NO通过HGF激活静息状态下的卫星细胞的信号作用，但Leiter等［18］采用不同年龄的小鼠，通过机械牵拉或NO刺激发现，随着年龄的增加，小鼠趾长伸肌中的卫星细胞激活数量对NO浓度越来越不敏感。而本实验的低氧训练模式下，骨骼肌NO升高，然而相应HGF、MAPK的含量出现下降。显然实验结果说明骨骼肌内NO的增加并未激活HGF、MAPK的活性，HGF、MAPK的下降与骨骼肌蛋白含量的变化是一致的。其原因可能是该低氧训练模式中，骨骼肌产生的NO与鸟苷酸环化酶活性部位的结合力下降，无法使cGMP水平上升而激活cGMP依赖的蛋白激酶系统而发挥生物学作用，但仍需进一步实验验证。

HGF是激活卫星细胞的重要细胞因子，具有促细胞有丝分裂的特性，是组织再生过程最重要的调控因子之一。其作用表现在两个方面:1)与卫星细胞的c-Met受体结合，通过MAPK和三磷酸肌醇激酶(IP3K)等有关基因转录和促细胞分裂的多个信号途径，激活卫星细胞［14，19］;2)HGF下调肌肉生长抑制素(myostatin)的表达，正向调控卫星细胞激活;然而HGF浓度过高会上调myostatin mRNA水平，增加myostatin蛋白的分泌和表达水平，从而使激活的卫星细胞恢复其安静状态［20－22］，因此 ，HGF浓度可对卫星细胞状态进行来负反馈调节。Wozniak和Anderson［23］的实验证明了这一结果，他们利用机械牵拉肌原细胞，能诱导内源性HGF的释放并上调卫星细胞表面c-Met的表达，并同时在培养基中添加高浓度HGF时，激活的卫星细胞数量却减少。从本实验结果可看出，相对于其他低氧训练模式，HHL这种低氧训练模式使大鼠骨骼肌HGF含量降低，而且其股四头肌蛋白含量呈现显著下降，然而导致HGF下降的原因可能与低氧训练强度有关，有待深入研究。

c-Met作为HGF受体，在骨骼肌细胞中以跨膜蛋白的形式结合在卫星细胞表面，起来信号转导作用，同时c-Met也是卫星细胞 一种特异性标记物。有研究［24］针对耐力和力量训练C57BL/6小鼠，发现其胫前肌c-Met mRNA表达水平显著增多，而混合训练组胫前肌c-Met mRNA表达增加不显著。本实验结果各组大鼠股四头肌c-Met含量变化不明显，说明骨骼肌卫星细胞并未出现明显激活。

MAPK是将细胞外信号传导到细胞核内引起生化反应的重要信号调控系统，它的激活介导了多条信号转导通路，并参与细胞生长、分化和凋亡等多种功能的调节。如NishimuraM等［25］研究发现脑缺血预适应可通过诱导p38 MAPK的激活来提高海马组织对缺血的耐受能力;运动和肌肉收缩增强MAPK信号分子活性，提高下游转录因子活性，直接影响相关转录因子的磷酸化［23－25］。如 Widegren 等［26］研究时发现以70%VO2max强度进行单腿功率自行车实验可以激活运动腿骨骼肌ERK1/2和p38信号通路，但非运动腿骨骼肌ERK1/2和p38没有活化。MAPK信号通路激活对运动形式、时间和强度有一定的依赖性。本实验中可看出低氧结合运动使得股四头肌内MAPK下降，而常氧运动组的MAPK存在上升趋势。综上，该低住并结合不同方式训练，均未能有效地激活骨骼肌卫星细胞，而使得肌蛋白丢失。

4 结论

1)四周高住高训低练可导致骨骼肌蛋白的丢失。

2)高住高训低练引起肌蛋白的减少与肌卫星细胞NOHGF-c-Met激活通路中HGF分泌减少及MAPK活性下降有关。

3)至于高住高训低练组肌组织NO的升高但未刺激HGF活性及MAPK磷酸化增加，该结果是否与低氧训练模式中的训练内容有关尚待进一步研究和探讨。

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