氟尿嘧啶的理化性质及透皮促渗剂对氟尿嘧啶经皮渗透的研究

★ 邹浪 李晓芳 邓红 曹森

(1.江西中医学院附属医院 南昌330006;2. 江西中医学院 南昌 330006)

氟尿嘧啶的理化性质及透皮促渗剂对氟尿嘧啶经皮渗透的研究

★ 邹浪1李晓芳1邓红1曹森2*

(1.江西中医学院附属医院 南昌330006;2. 江西中医学院 南昌 330006)

目的：对氟尿嘧啶的理化性质进行研究，并考察促渗剂对氟尿嘧啶透皮吸收的影响，为氟尿嘧啶经皮给药剂型的设计提供理论依据。方法：考察温度、光照及pH对氟尿嘧啶稳定性的影响；测定氟尿嘧啶在水、不同pH磷酸盐缓冲液以及多种油和表面活性剂中的溶解度；采取改进的Franz扩散池和离体小鼠皮肤研究氟尿嘧啶在不同pH环境下以及添加促渗剂后对离体鼠皮透皮吸收的影响。结果：在4℃、25℃、32℃、60℃条件下，在pH5.0、pH7.4、pH8.0磷酸盐缓冲液中，在光照条件(4 500 Lx)下，氟尿嘧啶均能稳定存在。氟尿嘧啶在水及不同pH磷酸盐缓冲液中的溶解度均大于在油和表面活性剂中的溶解度。氟尿嘧啶在水和不同pH磷酸盐缓冲液中的体外经皮释放均符合零级释放。含不同促渗剂的氟尿嘧啶的透皮速率及累积渗透量有明显差别，其促进强度依次为桉叶油>薄荷油>氮酮>H二乙二醇单乙基醚H>N-甲基-2-吡咯烷酮。结论：氟尿嘧啶不受温度、光照、pH值的影响；制成经皮给药制剂时，桉叶油的加入对氟尿嘧啶的促渗作用最大。

氟尿嘧啶；稳定性；溶解度；促渗剂；透皮作用

5-氟尿嘧啶(5-Fu)是一种具有抗癌活性的抗代谢药物，局部应用时依靠其细胞毒性，对增殖细胞进行有效杀灭，可用于治疗光角质化病、鳞状细胞癌、浅表基底细胞癌等多种皮肤癌和尖锐湿疣、白癜风、银屑病等一系列顽固性皮肤病。[1]但5-Fu极性大，脂溶性差，难以通过皮肤角质层到达癌变区域，使其治疗作用受到很大限制。研究者们采取多种方法以增强其透过能力，如离子电渗疗法[2]、激光处理[3]、前体药物[4]和添加促透剂[5-6]等。

微乳是由表面活性剂、助表面活性剂、油相和水组成的澄清、稳定和各向同性的热力学稳定分散体系。[7]研究表明，W/O型微乳因为具有增加亲水性、难渗透药物与角质层的相容性、改变脂质双分子层结构、较小粒径及易透过皮肤毛囊孔[8]等性质，成为可能解决亲水性药物经皮渗透问题的一个新途径。经前期研究制备了5-Fu W/O型微乳，体外透皮实验结果表明，12h累积透过量分别为0.5%5-Fu水溶液和2.5%市售乳膏(O/W型)的19.1倍和7倍，可见W/O型微乳的确促进了5-Fu的皮肤透过能力。[8]因此，选择合适的经皮给药剂型能显著的改善药物的透皮效果。本文对5-Fu进行了处方前研究，测定了5-Fu在水、不同pH缓冲盐溶液以及多种油和表面活性剂中的溶解度，考察了5-Fu溶液的稳定性，对不同pH环境以及添加一系列促渗剂后5-Fu的经皮渗透进行了研究和探讨，获得5-Fu皮肤吸收及经皮渗透规律，为5-Fu经皮吸收制剂研究提供依据。

1 材料

1.1 试剂

氟尿嘧啶(5-Fu，纯度98%，山东临邑氟瑞精细化工有限公司)；2.5%氟尿嘧啶乳膏(广东顺峰药业有限公司)；磺化琥珀酸二辛酯钠(AOT，北京百灵威公司)；吐温80(Tween80)、吐温85(Tween85)、吐温20(Tween20)、丙二醇(PG)(上海国药集团化学试剂有限公司)；司盘80(Span80)、乙醇(Ethanol)、聚乙二醇400(PEG400)、油酸乙酯(Ethyl oleate)(上海化学试剂有限公司)；油酸(OA，淄博丰森油脂化工有限公司)；丙三醇(Glycerol，上海华蓝化学科技有限公司)；桉叶油(Eucalyptus，郑州锦德化工有限公司)；薄荷油(Peppermint，郑州浩力化工有限公司)；肉豆蔻酸异丙酯(IPM)、棕榈酸异丙酯(IPP)(英国Croda公司)；聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯(CremorpH EL，德国BASF公司)；亚油酸聚乙二醇甘油酯(Labrafil 2125CS)、辛酸/癸酸三甘油酯(GTCC)、丙二醇月桂酸酯(HLauroglycolTMFCCH)、丙二醇辛酸酯(HCapryolTMPGMCH)、丙二醇单辛酸酯(HCapryolTM90H)、聚甘油酸酯(HPlurol®oleique CC 497H)、辛酸葵酸聚乙二醇甘油酯(Labrasol®)、单亚油酸甘油脂(Maisine35-1)、中链甘油三酯(HLabrafacTMWL 1349H)、二乙二醇单乙醚(Transcutol P)(法国Gattefosse公司)；聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯(Solutol®HS 15，德国BASF有限公司)；辛癸酸甘油酯(ODO，浙江千岛精细化工厂)；氮酮(Azone，广州助剂化工厂)；N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP，上海ISP有限公司)；甲醇(色谱纯，上海国药集团化学试剂有限公司)。

1.2 仪器

高效液相色谱仪(LC-10AT VP，SPD-10A VP紫外-可见检测器,日本岛津公司)；透皮扩散试验仪及改进的扩散池(上海锴凯科技贸易有限公司)。

1.3 动物

昆明种小鼠(♂，体质量18-22g，江西中医学院实验动物中心。动物合格证号:2011-0188)。

2 方法

2.1 含量测定方法

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Diamonsil ODS C18(4.6mm×250mm,5μm)；流动相：甲醇-水(90∶10,v/v)；流速：1.0mL/min；检测波长：266nm；柱温：30℃；进样量：20μL。

2.1.2 标准曲线的制备 精密称取5-Fu适量,用流动相配成浓度为1.0mg/mL的贮备液，然后用流动相分别稀释成1、10、30、50和80μg/mL的系列对照品溶液,在上述色谱条件下各取20μL进样。

2.1.3 样品溶液的配制 精密量取含5-Fu的溶液0.1mL于10mL量瓶中，加5mL甲醇，超声10min，用流动相稀释至刻度，进样20μL，带入标准曲线计算药物含量。

2.2 5-Fu溶液的稳定性研究

2.2.1 温度及光照对5-Fu稳定性的影响 用去离子水配制浓度为5mg/mL的5-Fu溶液于具塞管中，分别保持4℃、25℃、32℃、60℃恒温或置于光照条件(4500 Lx)下，于第0、5、10d取样。

2.2.2 不同pH缓冲液对5-Fu稳定性的影响 分别用pH5.0、pH7.4、pH8.0磷酸盐缓冲液配制浓度为5 mg/mL的5-Fu溶液于具塞管中，室温放置，于第0、5、10d取样。

2.3 5-Fu在不同载体中溶解度的测定

分别量取5 mL去离子水、各种缓冲液、油及表面活性剂于10 mL具塞管中，分别加入500 mg 5-Fu，涡旋3min，于25℃摇床振荡72h，12 000r/min离心15min，取上清液用0.45μm微孔滤膜保温过滤，用甲醇稀释适当倍数后，取20μL进样。

2.4 小鼠离体皮肤的体外经皮渗透实验

将小鼠断颈处死后，剃除其腹部毛发，剪下腹部皮肤，除去皮下脂肪，用生理盐水冲洗皮肤内表面。将皮肤固定在扩散池的上、下两室之间，角质层朝上，接受液为0.9%的生理盐水溶液(接受池体积为17.2mL，透过面积为2.83cm2)，释放液为药液1mL(浓度均为5mg/mL)。将装置置于(32±0.5)℃恒温水浴中，开动搅拌(300r/min)，分别于0.5、1、2、4、6、8、10、12h取样2mL，同时补加相同温度等体积新鲜接受液。样品过0.22μm微孔滤膜，取样品续滤液1mL用HPLC测定药物浓度，计算药物的单位面积累积透过量(Qn)。对各组累积透过量进行独立t检验。

以Qn和经皮渗透速率(Jss)为指标，进一步筛选促渗剂。给药池中是含药溶液,接受池中溶液能溶解药物的量远大于药物的饱和溶解度，满足漏槽条件，可用下式计算Qn:

用下式计算药物经皮渗透速率：

1-1式中：Cn为第n个取样点浓度(μg/mL)，Ci为第i个取样点浓度(μg/mL)，Vo为接收池的体积(mL)，V为每次取样的体积(mL)，A是本扩散装置的扩散面积，为2.83cm2。以Qn(μg/cm2)对t(h)作图，所得曲线斜率即为Jss(μg/(cm2·h))。

2.5 促渗剂的加入方法

促渗剂的加入方法有直接加入样品溶液法[9]以及皮肤预处理法，[10]本文采取直接加入法，将一定含量的促渗剂直接加入到样品溶液中，室温下搅拌30min，使其混合均匀。本文分别选择氮酮(3%，w/w)，桉叶油(2%,w/w)，薄荷油(2%,w/w)，N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP,5%,w/w)，TranscutolP(5%,w/w)为促渗剂进行考察。

3 结果与讨论

3.1 标准曲线的制备

A.空白；B.对照品；C.样品

由图1可知，5-Fu的保留时间为5.3min左右，在本实验条件下其他成分对药物测定没有干扰。以峰面积A对质量浓度C(μg/mL)线性回归，得标准曲线方程：A=60793C+143.4(r=1)，线性范围1-80μg/mL，方法回收率为102.4%，日间、日内RSD(%)分别为0.3和0.4，结果表明该分析测定方法准确、可靠，满足含量测定要求。

3.2 温度、光照和pH对5-Fu稳定性的影响

表1 温度、光照和pH对5-Fu稳定性的影响

温度、光照和pH对5-Fu稳定性的影响结果见表1。结果表明5-Fu溶液在4℃、25℃、32℃、60℃下，在pH5.0、pH7.4、pH8.0磷酸盐缓冲液中，在光照条件下放置10d，药物含量基本没有发生变化，表明含有5-Fu的制剂制备时不需要考虑溶液温度、pH及光照的影响。

3.3 去离子水以及不同pH值缓冲液中5-Fu的溶解度

5-Fu在去离子水以及pH5.0、pH7.4、pH8.0的磷酸盐缓冲液中的溶解度见表2。结果表明，5-Fu在不同pH条件下溶解度不同。在pH 5.0～pH 8.0范围内，5-Fu随溶液pH的增大溶解度增大。这与5-Fu是一个二元弱酸结构密切相关，据文献报道[9]，5-Fu的PKa1=8，PKa2=13，pH越高其离子型所占比例越大，随之溶解度也越大。

表2 5-Fu在水和不同pH值缓冲液中的溶解度

3.4 不同油中5-Fu的溶解度

5-Fu在一系列油中的溶解度见表3。5-Fu由于极性较大，在油中溶解度均较小。比较而言，5-Fu在Masine35-1中的溶解度最大，Labrafil 2125CS次之，而在具有透皮促进作用并与皮肤相容性较好的油相IPM、IPP里溶解度却非常低。

表3 25℃ 5-Fu在不同油中的溶解度

3.5 不同表面活性和助表面活性剂中5-Fu的溶解度

由表4可知，表面活性剂和助表面活性剂对亲水性药物5-Fu增溶作用较小，其溶解度均小于药物在水中的溶解度(12.10±0.16mg/mL)。相比较而言，表面活性剂中，药物在Solutol®HS 15中溶解度最大，在Tween85中次之。药物在助表面活性剂中的溶解度以在PG中最大，Transcutol P次之。由表2、3、4的结果可知，氟尿嘧啶在水及不同pH磷酸盐缓冲液中的溶解度均大于在油和表面活性剂中的溶解度，适合制成W/O型微乳。

表4 25℃ 5-Fu在不同表面活性剂和助表面活性剂中的溶解度

3.6 5-Fu在去离子水和不同pH缓冲液中的体外经皮渗透

5-Fu在去离子水和不同pH的缓冲液中的经皮渗透结果见图2和表5。5-Fu水溶液和缓冲溶液的体外经皮释放均符合零级释放。在去离子水和pH 7.4缓冲液中的累积渗透量经独立t检验没有显著性差别，均大于5-Fu在pH 5.0和pH 8.0缓冲液中的累积渗透量，这个结果与Brahma N. Singh[6]报道的结果相一致：5-Fu是一个二元弱酸，当pH在5～8之间变化时其分子型在溶液中所占的比例在不断的减少，但对于5-Fu这类亲水性药物来说，其离子型和分子型均能够通过一定方式透过皮肤(离子型药物可能可以通过细胞旁路进行渗透)。在溶液pH达到7.4时，药物在溶液中分子型和离子型可能达到最佳渗透比例，累积渗透量最大。因此，制备5-Fu的透皮制剂除了使用去离子水做溶剂外，也可以考虑pH 7.4磷酸盐缓冲液做溶剂。

-■-pH5.0-◆-pH7.4-▲-pH8.0-◇-去离子水

表5 5-Fu水溶液及不同pH缓冲盐溶液的经皮渗透量和经皮渗透速率±s,n=6)

3.7 不同促渗剂对5-Fu经皮渗透的影响

表6 含有不同促进剂的5-Fu水溶液的经皮渗透量和经皮渗透速率±s,n=6)

目前促进药物经皮渗透的方法有很多种，但化学促渗剂仍占有很重要的位置。文献报道促渗剂Azone(3%，w/w)，[6,9]桉叶油(2%,w/w)，薄荷油(2%,w/w)，[11]NMP(5%,w/w)，[12]Transcutol P(5%,w/w)对5-Fu或其它亲水性药物经皮渗透有着较好的促渗作用，因此，本实验分别考察了上述物质对5-Fu体外经皮渗透行为的影响，并与未加促渗剂的5-Fu水溶液的渗透行为做比较，结果见表6。

与对照组相比，在含药水溶液中加入了3%Azone，5%NMP，2%桉叶油，2%薄荷油，5%Transcutol P之后，5-Fu的12h累积经皮渗透量分别提高了1.9，1.49、3.57、2.2、1.7倍。可见，桉叶油对5-Fu的促渗作用最大。桉叶油[12]是一类具有芳香气味的萜烯类物质，它可以通过提高脂质双分子层的流动性来增加药物的扩散系数，增加药物从基质向角质层的分配，并能刺激皮下毛细血管的血液循环，所以具有较强的促渗作用。因此，在5-Fu经皮给药制剂中可以考虑加入桉叶油作为促渗剂。

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征稿启事

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StudyonPhysicochemicalPropertiesofFluorouracilandPercutaneousEffectofTransdermalEnhancersuponTransdermalAbsorptionofFluorouracilThroughMiceSkin

ZOULang1,LIXiao-fang1,DENGHong1,CAOSen2*

1.JiangxiCollegeofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330004;2.JiangxiUniversityofTCM,Nanchang330006

OBJECTIVE:To study physicochemical of fluorouracil (5-Fu) and percutaneous effect of transdermal enhancers upon transdermal absorption of 5-Fu through mice skin. METHODS The physicochemical properties in vitro including stability under the condition of illumination, different temperatures and pH and solubility in water, different pH phosphate buffers, oil or surface were determined. The permeation flux of 5-Fu across excised mice skin was determined in vitro using Franz diffusion cell to study the influence of different pH phosphate buffers and the addition of transdermal enhancers. RESULTS The 5-Fu could be stable under the condition of illumination (4500 Lx), 4 ℃，25 ℃，32℃，60 ℃ and pH 5.0，pH 7.4，pH 8.0 phosphate buffers. The solubility of 5-Fu in water and different pH phosphate buffers were greater than that in oil or surfactant. The percutaneous absorption of 5-Fu in water and different pH phosphate buffers in vitro were zero order releasing kinetics. Several enhancers exhibited different effects, the order of effect was eucalyptus oil> peppermint > azone>transcutol P> NMP, CONCLUSIONS 5-Fu was made for W / O microemulsion and eucalyptus oil was the most effective one.

5-Fu; Stability; Solubility; Transdermal Enhancers; Transdermal Role

*通讯作者：曹森(1983-)，男，江西鄱阳人，硕士，助教，Tel：0791-87118777，E-mail：94183761@qq.com。

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2013-05-27)