运动对 RBP4诱导的胰岛素抵抗大鼠血液 IL－2、IL－2R表达以及CD4、CD8活性的影响

汪君民，龚腾云

Institute ofSports Science， Nantong University， Nantong 226007，Jiangsu，China

视黄醇结合蛋白4(RBP4)主要是由脂肪细胞分泌的，是特异性结合视黄醇的蛋白质中的一类［1］。研究发现，RBP4这一脂肪因子会导致胰岛素抗性，对胰岛素抗发展起到一个关键作用，在具有胰岛素抗性的小鼠体内及肥胖、2型糖尿病病人体内，血清RBP4的水平升高［2］。升高的RBP4水平与心血管危险因子关系密切，并且可用来作胰岛素抵抗程度的评价［3］。研究表明，运动训练可以降低不同年龄阶段的研究对象的RBP4水平［3－4］，提示运动可以通过RBP4水平的降低来提高胰岛素的敏感性。

糖尿病的病因及发病机制尚未完全阐明，但最近炎症学说颇受关注，认为炎症在其发病机制中起重要的媒介作用。其中多种细胞因子包括许多白细胞介素介导了此类反应。白细胞介素通过自分泌、内分泌和旁分泌的方式加速或者抑制此类炎症反应的过程。而其中的IL－2与糖尿病的发病和进程，以及与糖尿病相关的心血管疾病的关系最为密切，并且IL－2还具有炎症和免疫系统之外的重要调节作用，如通过全身给药IL－2能阻止非肥胖糖尿病小鼠的病程［5］等。而在胰岛素抵抗情况下，运动导致IL－2及其受体水平如何变化目前未见相关报道。

本研究采用重组RBP4注射活体大鼠，获得高RBP4诱导的胰岛素抵抗大鼠模型，观察运动后胰岛素抵抗和免疫指标变化，为临床控制胰岛素抵抗及糖尿病和其心血管并发症提供新的思路和靶点。

1 研究材料与方法

1.1 材料

胰岛素(Sigma－Aldrich)、2－Deoxy－D－［I－3H］－glucose(Sigma－Aldrich)、RBP4ELISA 试剂盒(Biosource)、胰岛素放射免疫试剂盒(Biogenesis)、重组 RBP4(Alexis)、IL－2、IL－2R 定量试剂盒，淋巴细胞亚群检测试剂盒均购自厦门慧嘉生物技术公司，以及酶联免疫检测仪，流式细胞仪(FCM)(Beckman Coulter)等仪器。

1.2 方法

1.2.1 重组 RBP4注射与运动方案

雄性SD大鼠8周龄22只，体重183～211 g，随机分成RBP4+运动组(RE)10只、RBP4安静组(RR)6只，2 组大鼠给予重组 RBP4 腹腔注射［2］，3 μg/g 体重，每12小时一次，持续注射4周。其余6只为安静对照组(C)。RE组大鼠按照Ploug方法［6］进行游泳训练4周，泳池为直径53 cm内壁光滑的塑料桶，水深70 cm，水温为35℃ ±2℃，游泳训练开始时间为晚上6点;大鼠 先进行每天15分钟适应性游泳训练共2天，从第3天开始采取每天无负重游泳，每次持续60 min，每周训练6天，周日休息，共持续4周。训练中，大鼠如出现反复下沉或溺水倾向，及时捞出，休息后片刻，再投入水中，直至补足60 min训练时间;同时使用小木棍及时驱赶，使大鼠持续运动，避免其出现抱团、漂浮等现象，保证训练效果。将安静对照组大鼠在浸水后捞出。游泳结束后捞出，以干毛巾擦拭，暖风机吹干。

1.2.2 血清RBP4和胰岛素抵抗指数的检测

采用双抗体夹心酶标免疫分析法测定RBP4;采用放射免疫分析法测定胰岛素。采用稳态模式评估法评价胰岛素敏感性，其原理是:假设外周组织和肝脏的胰岛素抵抗相等，按胰岛素和血葡萄糖在周围组织、肝和胰腺等不同器官的相互影响而建立起来的数学模型。模型的计算公式为:HOMA－IR(稳态模型的胰岛素抵抗指数)=空腹胰岛素(国际单位/L)×以空腹葡萄糖(mmoL/L)/22.5。

1.2.3 免疫学指标检测

外周血中 IL－2、IL－2R的含量检测用 ELISA法;CD4、CD8的活性测定用S－P一步法;均参照试剂盒说明书进行操作。

1.2.4 胸腺及脾脏指数:用分析天平称取胸腺及脾脏重量后，计算依据下列公式:胸腺(或脾脏)指数(g/100 g)=100×胸腺(或脾脏)重量/体重。

1.3 统计学处理

所有数据均采用SPSS19.0程序处理，以平均数±标准差()表示，Kolmogorov－Smirnov检验数据的正态分布，组间进行方差分析，采用 LSD检验，P＜0.05为差异具有统计学意义，P＜0.01为差异具有显著统计学意义。

2 结果

2.1 血清RBP4和胰岛素抵抗指数变化

4周后，RE组和RR组大鼠血清 RBP4水平显著高于C组(P＜0.01);RE组大鼠血清RBP4水平显著低于RR组(P＜0.01);RE组和 RR组大鼠 HOMAIR显著高于C组(P＜0.01);RE组大鼠HOMA－IR显著低于RR组(P＜0.01)(见表1)。

表1 血清RBP4和胰岛素抵抗指数变化

2.2 外周血中IL－2、IL－2R的表达变化

表2 外周血中IL－2、IL－2R的表达变化

4周后，RR组和C组大鼠外周血IL－2、IL－2R表达差异不大;RE组大鼠外周血IL－2表达高于RR组(P＜0.05)，而IL－2R表达明显低于 RR组(P＜0.05);其比值高于 RR 组(P ＜0.01)。

2.3 外周血中CD4、CD8活性及CD4/CD8比值变化

表3 外周血中CD4、CD8活性及CD4/CD8比值变化

4周后，RR组和C组大鼠外周血CD4、CD8活性及CD4/CD8比值差异不大;RE组大鼠外周血CD4活性明显高于RR组(P＜0.05)，而CD8活性明显低于RR 组(P ＜0.05);其比值高于 RR 组(P＜0.01)。

2.4 大鼠体重、胸腺指数、脾脏指数的变化

表4 大鼠体重、胸腺指数、脾脏指数的变化

4周后，RR组与C组大鼠相比，体重、胸腺指数、脾脏指数都有所下降(P＜0.05);而RE组与C组大鼠相比体重无显著差异，与RR组比胸腺指数(P＜0.05)、脾脏指数明显提高(P ＜0.01)。

3 讨论

3.1 大鼠血清 RBP4变化情况

胰岛素抵抗不仅是2型糖尿病的发病基础，还是代谢综合征(糖尿病、肥胖、高血压病、动脉粥样硬化、脂肪肝等疾病)的共同的病理基础。胰岛素能够提高组织对葡萄糖的摄取率，机制是胰岛素与靶细胞的胰岛素信号蛋白相互作用，最终能够增加葡萄糖转运体从细胞内池向细胞膜的运动［7］。胰岛素在不同的组织、细胞中通过复杂的信号级联放大作用发挥不同的生理作用。

本研究中，大鼠经过RBP4注射4周后，与C组相比，RE组和RR组大鼠均出现胰岛素抵抗;对RBP4注射后的大鼠进行运动干预后发现，虽然大鼠血清RBP4水平仍高于C组，但与RR组比明显下降。与此对应的是:RE组和RR组大鼠胰岛素抵抗指数显著高于C组，RE组大鼠明显低于RR组。说明运动能够抵抗RBP4诱导的胰岛素抵抗。

3.2 大鼠外周血IL－2及IL－2R表达变化情况

IL－2是由Th细胞IL抗原或丝裂原刺激下和IL－1诱导下分泌的一种15KD的糖蛋白，能够促进淋巴细胞有丝分裂，增强杀伤细胞(如T杀伤细胞、NK细胞)的杀伤功能和辅助抗体生成等，在机体的免疫应答及调节中起着重要的作用。血清中IL－2水平是末梢血单核细胞功能的一个敏感而又量化的指标，它可以影响其他组织或体液成分的免疫活性。白细胞介素2受体有两种，即存在于细胞表面的IL－2膜受体(mIL－2R)和存在于体液中的可溶性IL－2受体(IL－2R)，这两种受体都可结合IL－2，中和活化T细胞周围过多的白介素2，具有免疫调控作用。IL－2的生物学作用是通过和靶细胞上特异性高亲和力的IL－2R相互作用来完成的。Tarnok等［8］研究发现，CPB(体外循环)术后外周血中的IL－2含量明显减少，并且减少的程度与CPB的时间相关。而王东等［9］学者认为，CPB使血中可溶性IL－2受体(IL－2R)含量明显增加，IL－2R与IL－2这两种成分结合使IL－2失活，从而抑制免疫反应。因此，一定程度上可将IL－2/IL－2R系统水平作为衡量机体免疫水平的指标之一。王会平［10］研究表明:IL－2对大鼠的心脏收缩功能具有明显抑制作用;可明显改善糖尿病(高葡萄糖浓度)诱发的血管内皮依赖性舒张功能减弱;可减弱高葡萄糖浓度诱发的冠状动脉血管阻力的升高。

本研究结果表明，RE组与RR组大鼠血清IL－2表达升高、IL－2R表达降低(P＜0.05)，且IL－2/IL－2R比值明显增大(P＜0.01)，其升高机理可能是4周运动训练作用于激活的T淋巴细胞，使其对IL－2R表达与释放减少，而IL－2R可结合血清中的IL－2，具有免疫抑制作用，这与文献报告的基本一致［11］。结合王会平的研究结果，说明运动不但能够改善胰岛素抵抗大鼠的免疫机能，而且能够改善心脏舒张功能，减弱冠状动脉血管阻力的升高，为胰岛素抵抗患者提供了锻炼防治糖尿病的科学依据。

3.3 大鼠外周血CD4、CD8活性及CD4/CD8比值变化

机体特异性免疫的重要组成部分之一是细胞免疫，T淋巴细胞是细胞免疫的效应细胞。其中CD4+T细胞主要是识别外源性多肽抗原，包括TI(诱导性T细胞)和Th(辅助性T细胞)两种;CD8+T细胞主要是识别内源性多肽抗原，包括Ts(抑制性T细胞)和Tc(细胞毒性T细胞)两种。CD4+和CD8+通过相互制约来维持免疫功能的平衡，二者的比值下降提示免疫抑制。

本研究测定结果，RE组大鼠外周血CD4活性明显高于RR组，CD8活性明显低于RR组，CD4/CD8比值明显增加。揭示运动训练对胰岛素抵抗大鼠的免疫功能有一定的正性调节作用。

3.4 大鼠体重、胸腺指数、脾脏指数组间关系

胸腺和脾脏是机体重要的免疫器官，其结构、功能的正常与否直接关系到机体的免疫功能是否正常。胸腺是T淋巴细胞发育、成熟的部位，为中枢免疫器官。脾是人体最大的外周免疫器官，是B淋巴细胞发育、成熟的，也是机体在抗原刺激下发生免疫应答的场所。故胸腺、脾脏结构的衰退和功能下降势必会影响机体的体液、细胞免疫功能，导致机体免疫功能失调。胸腺指数和脾指数是依据机体体重来计算的，与体重成正比，故胸腺指数、脾指数是直接反映胸腺、脾免疫功能的重要指标［12］，两者的高低变化反映了机体体内免疫功能的状态。

本实验结果显示，RR组大鼠体重、胸腺指数、脾脏指数均低于对照组C组，表明RBP4诱导的胰岛素抵抗大鼠体重胸腺指数、脾脏指数明显降低。而RE组胸腺指数、脾脏指数均高于RR组，则说明耐力运动能显著提高模型大鼠胸腺指数及脾脏指数，提高机体免疫力，增强防病抗病能力。

3.5 研究缺陷和进一步研究的方向

本试验只采用了游泳这种单一的练习方式，没有设置专门的力量练习组。而有文献认为，适当的力量或抗阻力方案设计对不适合进行走、慢跑、有氧健身操等练习的2型糖尿病患者是可行而且有效的［13］。规律运动可能通过调节胰岛素抵抗大鼠的炎症状态，提高患者的自身免疫力，达到防治糖尿病的目的，然而具体采用的运动方式、运动强度、频度、持续时间等都还需要更多的运动试验进行探讨。

4 结论

RBP4诱导的胰岛素抵抗大鼠免疫功能有所下降;运动提高RBP4诱导的胰岛素抵抗大鼠Th细胞分泌IL－2的能力，减少存在于细胞表面游离的可溶性受体(IL－2R)的表达与释放;运动能够明显提升RBP4诱导的胰岛素抵抗大鼠免疫能力。该研究在探讨胰岛素抵抗患者免疫功能紊乱的发生机制、临床治疗和预后判断方面有重要意义。

［1］Quadro L，Blaner WS，Salchow DJ，et al.Impaired retinal function and vitamin A availability in mice lacking retinol－binding protein［J］.EMBO J，1999(18):4633 –44.

［2］Yang Q，Graham T E，Mody N.Serum retinol binding protein 4 contributes to insulin resistance in obesity and type 2 diabetes［J］.Nature，2005，436(21):356 － 362.

［3］Graham T E，Yang Q，Bluher M，et al.Retinol－binding protein 4 and insulin resistance in lean，obese，and diabetic subjects［J］.N Engl J Med，2006，354(24):2552－2563.

［4］Lim S，Choi S H，Jeong I K，et al.Insulin － sensitizing effects of exercise on adiponectin and retinol－ binding protein－ 4 concentrations in young and middle－ aged women［J］.J Clin Endocrinal Metab，2008，93(6):2263－ 2268.

［5］钱令波，王会平，黄翯，等.白细胞介素－2改善糖尿病大鼠血管内皮依赖性舒张功能［J］.中国应用生理学杂志，2007，23(2):204－209.

［6］Ploug T，Stallknecht BN，Pedersen D，et al.Effect of endurance training on glucose transport capacity and glucose transporter expression in rat skeletal muscle［J］.Am J Physiol，1990(259):778－786.

［7］Kwiecinski A，Nowak P.Effect of prenatal manganese intoxication on glucose uptake in the brain of rats lesioned as neonates with 6－ hydroxydopamine［J］.Pharmacol Rep，2009，61(3):558－ 563.

［8］Tarnok A，Schneider P.Pediatric cardiac surgery with cardiopulmonary bypass:pathways contributing to transient systemic immune suppression［J］.Shock，2001，16(Suppl 1):24－32.

［9］王东，孙宗全，黄毅，等.体外循环中不同氧合方式对T淋巴细胞免疫功能的影响［J］.中华胸心血管外科杂志，1999，(15):98－99.

［10］王会平.白细胞介素－2对糖尿病性心血管功能改变的影响及其相关机制研究［D］.杭州:浙江大学，2008.

［11］仲人前.细胞因子与自身免疫性疾病的关系［J］.中华医学检验杂志，2000，23(4):200.

［12］刘茜，刘向国，武松.肺气肿肺气虚证模型大鼠脾脏指数、胸腺指数变化的实验研究［J］.甘肃中医学院学报，2006，23(1):20－22.

［13］Eves ND，Plotnikoff RC.Resistance training and type 2 diabetes:considerations for implementation at the population level［J］.Diabetes Care，2006(29):1933 －41.