胶冻样类芽孢杆菌CX-9菌株肥料制剂的研制及在烟草上的应用

张爱民，张双凤，赵钢勇，朱宝成，李淑娜

(1.河北农业大学 生命科学学院，河北 保定 071001；2.河北大学 生物技术中心，河北 保定 071002)

胶冻样类芽孢杆菌CX-9菌株肥料制剂的研制及在烟草上的应用

张爱民1,2，张双凤2，赵钢勇2，朱宝成1，李淑娜1

(1.河北农业大学 生命科学学院，河北 保定 071001；2.河北大学 生物技术中心，河北 保定 071002)

为研究胶冻样类芽孢杆菌CX-9菌株肥料制剂对烟草品质的改善和产量的提高，通过自行分离的胶冻样类芽孢杆菌CX-9菌株的发酵、发酵液离心和后处理，研制出含菌量高达50.0×108/g的肥料制剂，并利用该肥料制剂在贵州烟草上进行了减少烟草专用肥的接种实验.研究结果表明:每公顷施用该肥料制剂30 kg，能促进烟株生长发育，提高烟叶产量、产值、均价、上等烟叶率和中上等烟叶率，改善烟叶内在化学品质，大大提高烟叶质量等级，同时底施该肥料制剂，还可减少20%的基肥施用，降低成本投入，增加烟农的收益. 因此,该胶冻样类芽孢杆菌CX-9菌株在烤烟生产上具有一定的应用价值.

胶冻样类芽孢杆菌；肥料制剂；田间实验；烟草

硅酸盐细菌是一类能分解硅酸盐矿物的细菌的俗称，1912年苏联学者亚历山罗夫[1]首先从蚯蚓肠道中分离出一株细菌，发现其能分解长石、云母、土壤矿物等铝硅酸盐类的原生态矿物，使土壤中难溶性K，P，Si等转变为可溶性物质供植物生长利用.1939年，研究人员直接从土壤中分离出这种细菌并命名为硅酸盐细菌(Silicatebacterium)[2].Alexandrov也报道，从岩石材料中分离出一株产黏液的能分解硅酸盐的细菌，并定名为胶质芽孢杆菌硅酸盐亚种(Baci11usmuci1aginosussubsp.si1iceus),但限于当时的条件未对其作进一步研究.因此该种的分类地位长期以来未得到国际承认.

1993年，研究人员经过对芽孢杆菌属51株菌种的16S rDNA序列测定和比较分析，将其分类命名为类芽孢杆菌属(Paenibacillus)[3].类芽孢杆菌属的菌株分布广泛，可以从土壤、水和不同的植物根际和植物体内分离得到[4-5],该属菌株的重要特点是大多产生具有拮抗作用二级代谢产物[6],胶冻样类芽孢杆菌也归为该属.但是该菌株不仅具有以上特点，同时还具有解钾、解磷、固氮等多种作用，在农业生产上的应用可以提高作物产量，改善农产品品质[7].

由于胶冻样类芽孢杆菌能够分解含钾硅酸盐矿物，因此以此菌株为主要活性成分俗称为生物钾肥的产品已在国内外被广泛应用.中国20世纪50年代推广使用的硅酸盐细菌制剂(生物钾肥)曾带来了良好的增产效果.该菌株在原苏联也进行了广泛研究.近年来，国内大量田间实验表明生物钾肥对各种喜钾作物如甘薯、烟草、水稻等有明显的增产作用[8-9].

硅酸盐细菌菌剂一直采用传统工艺制造，限制了该项技术的推广和应用.本文采用新分离的胶冻样类芽孢杆菌CX-9菌株，通过发酵、离心和喷雾干燥工艺处理，并与草炭载体复配，研制出了含菌量高达50.0×108/g的肥料制剂.应用该制剂在中国烟草主产区贵州省的烟草上进行了大田对比实验，实验结果表明:施用该肥料制剂可减少传统烟草种植模式专用肥的用量，并可提高烟草产量，改善烟草品质.

1 材料和方法

1.1供试菌种

胶冻样类芽孢杆菌CX-9菌株，河北农业大学农业微生物学研究室分离保藏.菌株分离自陕西小麦田.

1.2供试作物

烟草品种-云87，为贵州省目前主要栽培品种.

1.3培养基

1.3.1 斜面培养基(g/L)

酵母粉7.0，酵母膏0.7，蛋白冻10.0，糊精2.0，磷酸氢二钠1.0，硫酸锌0.2，硫酸钙0.2，琼脂20.0.

1.3.2 种子培养基(g/L)

蔗糖10.0，硫酸铵1.0，磷酸氢二钾2.0，酵母膏0.4，硫酸锰2.0，醋酸钙 1.0，三氯化铁0.2，pH 7.0～7.2.

1.3.2 发酵培养基(g/L)

磷酸氢二钾2.0，蔗糖20.0，硫酸锰2.0，硫酸铵0.8，醋酸钙1.5，酵母膏0.5，pH 7.0～7.2.

1.4胶冻样类芽孢杆菌CX-9菌株肥料制剂的研制

1.4.1 菌种的活化

将胶冻样类芽孢杆菌CX-9菌株保存菌种转接至斜面培养基，30 ℃恒温培养48 h.

1.4.2 种子培养

250 mL三角瓶中分装种子培养基，121 ℃，30 min灭菌，冷却至室温后接种胶冻样类芽孢杆菌CX-9菌株菌种，恒温摇床振荡培养，培养条件：温度30 ℃，转速200 r/min，周期14～18 h.

种子含菌量的测定方法(血球计数板法)：取培养(发酵)到终点的培养液1.0 mL，加到含有9.0 mL无菌水的试管中，充分振荡1 min，再按照同样方法加到第2支试管中，充分振荡1 min后，用滴管加到血球计数板计数室内，沉淀片刻后，在显微镜高倍镜下数5个中方格的菌体数量计数，则培养液的含菌量按如下公式计算：

含菌量=(5个中方格菌数之和)÷5÷4×108/mL.

1.4.3 发酵实验

用50 L全自动发酵罐进行实验，培养基为发酵培养基，装料系数为70 %，121 ℃灭菌 30 min，冷却至室温后，负压法接种液体菌种.

发酵液含菌量的测定方法(活菌计数法)：分别吸取5.0 mL发酵液加入45 mL无菌水中，按体积比1∶10进行梯度稀释，分别得到10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7稀释度的菌悬液.然后每个样品取3个连续适宜的稀释度，用0.5 mL无菌移液管分别吸取不同稀释度菌悬液0.1 mL，均匀地涂布于检测培养基平板上.每一稀释度重复3次，同时以无菌水作空白对照，32 ℃培养 48 h，以出现20～300个菌落数的稀释度的平板为计数标准，分别统计有效活菌数.

含菌量(/mL)=(3个平板菌落数之和)÷3×10×稀释倍数.

1.4.4 CX-9菌株肥料制剂的制备及质量检测[10]

将CX-9菌株3批次发酵的发酵液收集在一个容器中，称重后离心，然后进行喷雾干燥.计数后与适量草炭混合，研制出高含菌量的肥料制剂.依据GB20287-2006《农用微生物菌剂》进行产品检验.

肥料制剂生物量的测定方法(平板计数法)：准确称取10.0 g肥料制剂加入100 mL无菌水中，按体积比1∶10进行梯度稀释，分别得到10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7稀释度的菌悬液.然后每个样品取3个连续适宜的稀释度，用0.5 mL无菌移液管分别吸取不同稀释度菌悬液0.1 mL，均匀地涂布于检测培养基平板上.每一稀释度重复3次，同时以无菌水作空白对照， 32 ℃培养48 h，以出现20～300个菌落数的稀释度的平板为计数标准，分别统计有效活菌数.

生物量(/g)=(3个平板菌落数之和)÷3×10×稀释倍数.

1.5CX-9菌株肥料制剂在烟草上的应用效果

1.5.1 试验地基本情况

试验在贵州龙岗烟草综合实验区内进行，质地黏壤，有机质质量分数2.78%，pH值6.12，碱解氮38.52 mg/kg，速效磷32.82 mg/kg，速效钾108.36 mg/kg，肥力中上等，前茬为水稻.

1.5.2 试验设计

采用同田简单对比设计，设2个处理，3次重复.实验面积0.4 hm2，外设保护行.T(接种)：CX-9菌株肥料制剂+4/5常规烤烟专用基肥；CK(对照)：常规烤烟专用基肥(N,P2O5,K2O的质量分数分别为10%,15%,15%), 对照和接种的肥料用量见表1.接种方法为用打洞器移栽，将CX-9菌株肥料制剂和300 kg干细土混合均匀后放在打洞器底部均匀施到每株烟草穴底部，然后放上烟苗即可.烟草追肥肥料N,P2O5,K2O的质量分数分别为10%,10%,20%.种植密度为16 500株/hm2，行距110 cm，株距55 cm.

表1 各处理肥料用量

1.5.3 物候期的调查及观测

观察记载各处理烤烟的团棵期、现蕾期和打顶期；测定各处理在团棵期和旺长期的株高、茎围、出叶数、最大叶长和叶宽；收获时分别计产.

1.5.4 田间管理

起垄、施肥、移栽、病虫害防治、中耕、培土上厢、打顶和采烤等按当地优质烟生产技术方案执行.

1.5.5 烟叶的化学成分分析

分别取各处理中部烟叶(C3F)和上部烟叶(B2F)进行化学成分分析.

2 结果与分析

2.1CX-9菌株肥料制剂的研制

2.1.1 菌种的活化和转接

将胶冻样类芽孢杆菌CX-9菌株的保藏菌种转接到斜面培养基上，30 ℃培养2 d，斜面表面变成白色，涂片后，在显微镜下观察，菌体全部变成芽孢，4 ℃冰箱保存.

2.1.2 种子培养

将胶冻样类芽孢杆菌CX-9菌株转接到种子培养基上，培养12～14 h，取样镜检，菌体成对或单个排列，菌体粗壮，结晶紫染色均匀，pH 6.0～6.3.计数含菌量为2.4×108/mL.

2.1.3 发酵培养

将胶冻样类芽孢杆菌CX-9菌株种子培养液，以负压法按7%接种量接种到50 L发酵罐中，培养条件为：温度35～37 ℃，罐压0.06 MPa，间歇搅拌，搅拌转速为200 r/min，通风比为1∶(0.3～0.5)(随时间而变化)，发酵周期36～40 h，并进行同步化验分析，pH值采用在线pH电极测定，含菌量采用稀释平板法测定，结果见表2.

表2 胶冻样类芽孢杆菌CX-9菌株3批次发酵实验结果

结果表明，胶冻样类芽孢杆菌CX-9菌株在50 L发酵罐发酵，3批次结果比较一致，平均含菌量达到7.8×108/mL，芽孢形成率在95%以上，发酵水平较高.

2.1.4 胶冻样类芽孢杆菌CX-9菌株肥料制剂的检验结果

将3批发酵液收集后离心，并进行喷雾干燥，测定芽孢菌粉的生物量为602.4×108/g，将菌粉和草炭按照质量比11∶1进行充分混合，研制出草炭为载体的胶冻样类芽孢杆菌CX-9菌株肥料制剂，按照GB20287-2006《农用微生物菌剂》所规定的方法进行相关项目的质量检测，结果见表3.

表3 CX-9菌株肥料制剂的检验结果

从表3看出，采用草炭为载体制成的胶冻样类芽孢杆菌CX-9菌株肥料制剂成品的含菌量远远高于GB20287-2006《农用微生物菌剂》所规定的技术指标，说明本生产工艺流程生产的肥料制剂符合农业部微生物肥料质量标准所规定的的技术指标，肥料制剂的研制方法可行.

2.2胶冻样类芽孢杆菌CX-9菌株肥料制剂在烟草上的应用效果

2.2.1 各处理对烤烟生育期的影响

接种胶冻样类芽孢杆菌CX-9菌株肥料制剂对烤烟生育期的影响不大，对照与接种处理的烟株均于5月8日移栽，6月10日进入团棵期，7月5日进入现蕾期，7月12日进入打顶期.

2.2.2 胶冻样类芽孢杆菌CX-9菌株肥料制剂对烤烟团棵期烟株农艺性状的影响

烟草生长到团棵期时进行相关农艺性状的调查和统计，结果见表4.

表4 各处理团棵期烟株农艺性状比较

表中数据均为5株的平均值.n=4时，t0.05=7.709,t0.01=21.98.

从表4得知，接种胶冻样类芽孢杆菌CX-9菌株肥料制剂的烟草株高较对照平均高0.4 cm，叶片数较对照平均多1.0片/株，茎围较对照粗1.0 cm，叶面积较对照增加113.65 cm2.其中对构成烟草产量的主要因素株高和叶面积进行了生物统计，t株高=19.267>t0.05=7.709，说明接种(T)与对照(CK)间达到显著性差异；t叶面积=23.947 7>t0.01=21.98 ，说明接种与对照间达到极显著性差异. 因而烤烟施用该胶冻样类芽孢杆菌CX-9菌株肥料制剂，能促进烟株前期生长发育.

2.2.3 胶冻样类芽孢杆菌CX-9菌株肥料制剂对烤烟旺长期烟株农艺性状的影响

烟株生长到旺长期时进行相关农艺性状的调查和统计，结果见表5.

表5 旺长期各处理烟株农艺性状比较

从表5看出，烤烟施用胶冻样类芽孢杆菌CX-9菌株肥料制剂后，烤烟的株高、叶片数、茎围和最大叶叶面积均好于对照.烟株株高较对照多1.6 cm，烟株叶片数较对照多2.0片/株，茎围较对照多0.7 cm. 其中对构成烟草产量的主要因素株高和叶面积进行了生物统计，t株高=19.267>t0.05=7.709，说明接种(T)与对照(CK)间株高达到显著性差异；t叶面积=23.947>t0.01=21.98 ，说明接种与对照间叶面积达到及显著性差异,为烟叶产量和品质的提高奠定了基础.

2.2.4 胶冻样类芽孢杆菌CX-9菌株肥料制剂对烤烟产量和产值的影响

烟叶收获后，进行产量和产值统计，并分析了上中等烟所占比例，结果见表6.

表6 不同处理对烤烟产值的影响

从表6可见，接种CX-9菌株肥料制剂烟叶产量为2 187 kg/hm2，较对照(CK)高147 kg/hm2， 烟叶产值较对照高4 711.5元/hm2， 烟叶均价、上等烟率和中上等烟率分别较对照(CK)高18元/kg、7.0%和8.3%. 因而烟草施用胶冻样类芽孢杆菌肥料制剂可以提高烟草种植的经济效益.

2.2.5 不同处理对烟叶化学成分的影响

烟叶收获后，分别取C3F叶片和B2F叶片，送贵州省烟草所进行相关化学成分的分析测定，结果见表7.

表7 不同处理对烟叶化学成分的影响

烟叶的化学成分是烟叶香味风格和品质特性形成的物质基础，烟叶香味风格是烟叶内在化学成分平衡的综合体现[11]. 烟碱是影响烟叶品质的重要因素之一，优质烟叶要保证一定的烟碱含量[12]. 总氮质量分数一般为1.5%～3.5%，以2.5%最佳，适宜的氮碱质量比最好接近1.0. 还原糖对烟叶品质起平衡作用，一般要求质量分数为16%～22%[13].烟叶氯质量分数以0.3%～0.8%为宜[14-15]，烟叶含氯量增加，糖类代谢受阻，淀粉积累过多.

烟叶的内在质量是判断烟叶质量好坏的主要依据，主要包括香气、杂气、吃味、劲头、刺激性、浓度、余味等.根据国内优质烟叶的评价，质量好的烟叶样品应还原糖含量较高，总氮含量较低，烟碱含量适中，K2O含量较高，两糖差值小，蛋白质含量较低，糖碱比、钾氯比、氮碱比均较高.

从还原糖上看，C3F处理(T)较对照高8.88%，B2F处理(T)较对照(CK)高1.39%，施用CX-9肥料制剂的C3F和B2F的还原糖含量均高于对照.

从总氮上看，C3F总氮处理(T)较对照低0.57%，B2F总氮处理(T)较对照(CK)低1.06%，施用CX-9肥料制剂的C3F和B2F的总氮含量均低于对照.

从烟碱含量上看，施用CX-9肥料制剂的C3F和B2F的烟碱含量均有所降低，但比较适宜，符合优质烟叶的烟碱范围.

从K2O含量上分析，C3F处理(T)较对照高0.56%，B2F处理(T)较对照(CK)高0.11%，因而施用CX-9肥料制剂的C3F和B2F的K2O含量均高于对照.

从糖碱质量比、钾氯质量比和氮碱质量比上看，施用CX-9肥料制剂的C3F和B2F的三者比值均比对照高，因而烟叶品质较好.

从以上5项优质烟叶的评价上看，施用CX-9肥料制剂可明显提高烟叶的内在质量.

3 结论

将胶冻样类芽孢杆菌CX-9菌株进行发酵、离心及干燥处理研制出含菌量高达50.0×108/g的高生物量菌粉(肥料制剂)，高于GB20287-2006《农用微生物菌剂》所规定的技术指标，证明该生产工艺生产的肥料制剂路线可行.

在烟草上施用胶冻样类芽孢杆菌CX-9菌株肥料制剂，可减少20%的烟草专用基肥用量，尽管对烤烟进入各个生育期的时间影响差异不大，但能促进烟株生长发育，对提高烟叶产量、产值、均价、上等烟叶率和中上等烟叶率的作用明显. 从还原糖上看，C3F处理(T)较对照高8.88%，B2F处理(T)较对照(CK)高1.39%，施用CX-9肥料制剂的C3F和B2F的还原糖含量均高于对照；从总氮上比较，C3F处理(T)较对照低0.57%，B2F处理(T)较对照(CK)低1.06%，施用CX-9肥料制剂的C3F和B2F的总氮含量均低于对照；从烟碱含量上看，施用CX-9肥料制剂的C3F和B2F的烟碱含量均有所降低，但比较适宜，符合优质烟叶的烟碱范围；从K2O含量上分析，C3F处理(T)较对照高0.56%，B2F处理(T)较对照(CK)高0.11%，施用CX-9肥料制剂的C3F和B2F的K2O含量均高于对照；从糖碱比、钾氯比和氮碱比上分析，施用CX-9肥料制剂的C3F和B2F的三者比值均比对照高，因而烟叶品质较好.从以上5项优质烟叶的评价上看，施用CX-9肥料制剂可明显提高烟叶的内在质量.

该肥料制剂对于提高烟草品质的的作用机理有待进一步探讨.

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ApplicationintobaccoandpreparationofthefertilizeragentofPaenibacillusmucilaginosusCX-9strain

ZHANGAimin1,2,ZHANGShuangfeng2,ZHAOGangyong2,ZHUBaocheng1,LIShuna1

(1.College of Life Science, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001,China;

2.Center of Biological Technology，Hebei University，Baoding 071002,China)

In order to study the improving of tobacco quality and increasing of tobacco yield byPaenibacillusmucilaginosusCX-9 strain, a kind of fertilizer agent has been produced. The fertilizer agent was get by fermentation, centrifugation and drying process ofP.mucilaginosusCX-9 strain and its biological amount can be reached to 50.0×108/g. The application experiments to reduce tobacco specific fertilizer were carried on in tobacco field in Guizhou province. As a result, with the application of 30 kg per hectare, the fertilizer agent had the ability of promoting tobacco plant growth, despite of this, the tobacco yield, production value, average price of tobacco leaf and rate of superior tobacco were promoted, and tobacco internal quality of chemistry were improved. Meanwhile, application of it could reduce tobacco basic fertilizer application 20%. So the costs of farmers could be reduced directly, and the income could be increased. Therefore, the application of fertilizer agent ofP.mucilaginosusCX-9 strain in tobacco planting have certain value-in-use.

Paenibacillusmucilaginosus; fertilizer agent; field experiments; tobacco

10.3969/j.issn.1000-1565.2013.04.010

2012-09-12

河北省科技支撑项目(06207125D-2)

张爱民(1967-)，男，河北武邑人，河北大学研究员,河北农业大学在读博士，主要从事农业微生物及土壤修复剂的研究.E-mail:zhangam2008@yahoo.com.cn

Q93

A

1000-1565(2013)04-0387-07

(责任编辑赵藏赏)