慈菇中抗真菌蛋白分离纯化初步研究

朱立成，罗 辉，曾 铂，殷帅文

慈菇中抗真菌蛋白分离纯化初步研究

*朱立成1，罗 辉2，曾 铂1，殷帅文1

（1.井冈山大学生命科学学院，江西，吉安 343009；2. 井冈山大学医学院，江西，吉安 343009）

植物在长期进化过程中，形成了一套天然的防御系统。其中植物抗真菌蛋白（antifungal protein，AFP）是主要成员之一，它对多种植物和人体病原真菌生长有抑制作用。本研究以慈菇（）块茎为材料，运用阳离子交换层析和葡聚糖G50凝胶过滤层析技术，结合活性追踪法，对慈菇中的抗真菌蛋白进行了初步分离纯化。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定表明，纯化的抗真菌蛋白并不是单一的组分，至少有3个电泳条带，分子量集中在14.4~20.1 kD之间。纯化的抗真菌蛋白对烟草赤星病菌（）的菌丝生长具有较明显抑制作用。

慈菇； 抗真菌蛋白；抗真菌活性

0 前言

植物在生长发育过程中随时会受到各种病原菌的侵染，所以在长期进化过程中，其自身形成了一套天然的防御系统，产生一些物质来与外源病菌对抗。植物抗真菌蛋白就是其中的一类，它们可抑制真菌生长或杀死真菌[1]。根据植物抗真菌蛋白血清学和蛋白质序列分析结果，可将植物抗真菌蛋白大致分为七大类，包括病程相关蛋白、防御素、类亲环素蛋白、核糖体失活蛋白、脂质转运蛋白、蛋白酶抑制剂、2s清蛋白类等。植物抗真菌蛋白种类较多，其抗真菌机制也各有不同，如富含半胱氨酸的防御素(Defensins)能引起真菌细胞通透性的改变，导致真菌细胞的死亡；几丁质连接蛋白(chitin-binding proteins)通过干扰细胞壁的极化从而使得细胞生长受抑制[2]等。所以，寻找新的植物抗真菌蛋白，或者发现新的植物抗真菌蛋白的抗真菌机制，对于开发抗真菌的新药具有重要的理论意义和应用价值。

慈菇（）为泽泻科多年生草本植物，以富含淀粉的球茎供食用。原产中国，欧洲作为观赏植物栽培，中国、日本、印度和朝鲜作蔬菜用。中国主要产区分布于长江流域及其以南各省，太湖沿岸及珠江三角洲栽培尤多，北方栽培较少[3]。传统医学认为，慈菇性微寒，味甘苦，无毒。入心、肝、肺三经，能清热利尿，行血通淋，化痰止咳。目前关于慈菇抗真菌蛋白方面的研究报道较少，本文对慈菇块茎中的抗真菌蛋白进行初步的分离纯化鉴定，并就其抗真菌活性进行研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 材料与试剂

慈菇购于上海市杨浦区某菜市场。阳离子交换层析剂CM-Sephadex、葡聚糖G50购自 GE Healthcare；标准分子量蛋白购于上海西巴斯生物技术有限公司；其余生化试剂均为国产产品。

1.1.2 菌种

烟草赤星病菌（）菌种由井冈山大学生命科学学院微生物实验室保存。

1.1.3 PDA培养基

称取马铃薯200 g，切碎加蒸馏水煮后，取滤液加入20 g葡萄糖，20 g琼脂定容至1000 mL，121℃灭菌20 min。待培养基冷却至50℃左右，加入千分之一的100 mg/mL氨苄青霉素，混匀后倒平板备用。

1.2 实验方法

1.2.1 抗真菌蛋白抽提

准确称取100 g慈菇，加入100 mL pH 5.7的磷酸盐缓冲液后磨碎，4℃抽提2 hr。抽提液经4层纱布过滤后，12000 rpm离心20 min，取上清备用。

1.2.2 阳离子交换层析

用pH 5.7的磷酸盐缓冲液平衡阳离子柱5-10个体积后，再将慈菇抽提上清液上柱。打开色谱工作站，280 nm检测。上样结束后分别用含0、0.1、0.3、0.5和1 mol/L NaCl的洗脱。收集洗脱峰浓缩后进行抑菌活性的测定。

1.2.3 凝胶过滤层析

有抑菌活性峰冻干粉中加入2~3 mL pH 5.7 的磷酸盐缓冲液，12000 rpm离心10 min ，上样到预先用pH 5.7 的磷酸盐缓冲液平衡的葡聚糖G-50层析柱中，pH 5.7 的磷酸盐缓冲液洗脱后收集各洗脱峰，各峰浓缩后进行抑菌活性的测定。

1.2.4 抑菌活性测定

采用琼脂纸片扩散法[4]。将烟草赤星病菌菌种分别接种于PDA固体培养基平板中央，置于28 ℃恒温培养箱培养18~20 h，待菌落直径达5 cm左右，在距离菌落边沿约0.5 cm处贴上无菌φ6.25 mm滤纸片，并加10 μL样品于滤纸片上，将平板置于28℃恒温箱中继续培养12 h左右后，观察有无抑菌作用。

1.2.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）[5]

有抑菌活性的凝胶过滤层析洗脱峰用SDS-PAGE电源鉴定，其分离胶浓度为15%，浓缩胶浓度为5%。恒压电泳2 hr左右后，用考马斯亮蓝R250染色、脱色后比较分析。

2 结果与分析

2.1 阳离子交换层析

利用阳离子交换柱对慈菇抽提液进行纯化，280 nm波长处检测，用含不同浓度NaCl的pH5.7的磷酸盐缓冲液洗脱，得到Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ等共5个洗脱峰，如图1所示。将各峰收集浓缩后测活，发现有抑菌活性的成分主要集中在Ⅲ和Ⅳ洗脱峰。

图1 慈菇抽提液阳离子交换层析色谱图

2.2 葡聚糖G-50凝胶过滤层析

将阳离子交换层析有抑菌活性峰Ⅲ、Ⅳ经冻干后溶解于pH5.7的磷酸盐缓冲液中，经过葡聚糖G-50层析柱凝胶过滤层析纯化后，活性峰Ⅲ分离出3个不同的洗脱峰（如图2所示），活性峰Ⅳ分离出4个不同的洗脱峰（如图3所示）。

图2 活性峰Ⅲ葡聚糖G50凝胶过滤层析图

图3 活性峰Ⅳ葡聚糖G-50凝胶过滤层析图

2.3 各层析峰抑菌活性检测

采用滤纸片扩散法对阳离子交换层析各洗脱峰进行测活，发现洗脱峰Ⅲ，Ⅳ具有较好的抗真菌活性，结果图4所示。

从图4可以看出，慈菇蛋白粗提液经过阳离子交换层析后，具有抑菌活性的AFPs主要存于洗脱峰Ⅲ和洗脱峰Ⅳ中，洗脱峰Ⅰ中也有少量的抗真菌物质，这些抗真菌物质对烟草赤星病菌菌丝生长具有抑制活性。

1. 磷酸盐缓冲液2. 洗脱液Ⅰ 3. 洗脱液Ⅲ 4. 洗脱液Ⅳ

1. Ⅲ①； 2. Ⅲ②；3. Ⅲ③； 4.磷酸盐缓冲液

活性峰Ⅲ经过G50凝胶过滤层析后，三个洗脱峰都有不同的抑菌效果，其中Ⅲ①活性峰抑菌效果稍差，而Ⅲ②、Ⅲ③活性峰抑菌效果较好。活性峰Ⅳ经过G50凝胶过滤层析纯化后，洗脱峰Ⅳ①、Ⅳ②、Ⅳ③抑菌效果较为明显，而洗脱峰Ⅳ④无明显抑菌效果。

2.4 SDS-PAGE电泳

将阳离子交换层析有抗菌活性峰Ⅲ和Ⅳ进行葡聚糖G50凝胶过滤层析后，收集各洗脱峰中的蛋白溶液经冻干浓缩至1~2 mL，取20 μL蛋白溶液加入5 μl 5×loading缓冲液混匀后进行SDS-PAGE电泳，电泳结果如图7所示。从图中可以看出，我们分离的抗真菌蛋白并不是单一的组分，至少有3个电泳条带，分子量集中在14.4~20.1 kD之间。

1. Ⅳ①； 2. Ⅳ②；3. Ⅳ③； 4. Ⅳ④

1. Ⅳ③；2. Ⅳ②；3. Ⅳ①；4. Ⅲ③；5. Ⅲ②；6. Ⅲ①；M：标准蛋白质分子量

3 讨论

作物真菌病害是植物病害中最为严重的一类，严重影响作物产量和品质。寻找具有广谱抗真菌活性的蛋白质，克隆其基因，利用基因工程的方法导入植物中培育出抗病品种，或者转入大肠杆菌或酵母里表达生产微生物农药是植物病害防治的重要方向之一，一些多肽抗生素已经用于植物抗病基因工程。随着对植物抗真菌蛋白作用机制的深入研究，越来越多的抗真菌蛋白基因将被鉴定和克隆，通过一些更有效的改良基因工程策略的建立，植物抗真菌蛋白将在植物真菌病害的综合防治中发挥更大的作用[2]。

植物抗菌蛋白通常为碱性蛋白。本研究利用阳离子交换层析和葡聚糖凝胶过滤层析等蛋白质分离纯化手段，结合活性追踪法，从慈菇中初步分离纯化出具有抑制烟草赤星病菌菌丝生长的抗真菌蛋白。虽然SDS-PAGE鉴定最终纯化的抗真菌蛋白并不是单一蛋白组分，但是可以初步判断慈菇中的抗真菌蛋白分子量大约为14.4kD左右。因为在慈菇中含有丰富的由179个氨基酸残基组成的慈菇蛋白酶抑制剂，分子量约为20 kD左右[6]，图7中20kD附近的蛋白质条带可能是慈菇蛋白酶抑制剂。但是，我们从预实验结果得知，纯化的天然慈菇蛋白酶抑制剂并没有抑制烟草赤星病菌菌丝生长的活性（实验结果未在本文显示）。所以慈菇中抗真菌蛋白应该是图7中14.4kD附近的两个蛋白质。关于慈菇块茎中抗真菌蛋白的进一步纯化、其它理化性质和作用机制有待于今后深入研究。

[1] 朱立成.中国紫藤种子抗真菌肽的研究[D].上海:中国科学院上海生命科学研究院,2010.

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PRELIMINARY STUDY ON ISOLATION AND PURIFICATION OF ANTIFUNGAL PROTEIN FROM

*ZHU Li-cheng1, LUO Hui2, ZENG Bo1, YIN Shuai-wen1

(1. School of Life Sciences, Jinggangshan University, Ji’an, Jiangxi 343009, China; 2. School of Medicine, Jinggangshan University, Ji’an, Jiangxi 343000, China )

Plant antifungal proteins, the key component of innate immune system in plant, show a great potential in inhibiting or killing various human and plant pathogenic fungi. In this study, we tracked the bioactivity of antifungal proteins, used a series of methods such as cation exchange chromatography and sephadex G50 chromatography to isolate the antifungal proteins from. The results show that the purified antifungal proteins fromare not a single component, at least three protein bands those molecular weight range from 14.4~20.1 kD were detected by SDS-PAGE. The experiments of antifungal activity show that the purified antifungal proteins apparently inhibit the growth ofhypha

; antifungal protein (AFP); antifungal activity

Q939.11/S154.3

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2013.04.007

1674-8085(2013)04-0033-04

2013-04-01；

2013-06-26

国家自然科学基金项目(31260076);江西省自然科学基金项目(2010GZN0125)

*朱立成(1972-），男，江西吉水人，副教授，博士，主要从事生物化学研究(E-mail：zjist@yahoo.com.cn)；

罗 辉(1971-），男，江西吉水人，副教授，硕士，从事生物化学与分子生物学研究(E-mail：jgsmcxb@163.com);

曾 铂(1985-），男，江西泰和人，井冈山大学生命科学学院本科生(E-mail：smkx05by@126.com);

殷帅文(1978-），男，湖南浏阳人，副教授，博士，主要从事天然产物研究与开发(E-mail：shwyin@126.com).