DADLE对急性全脑缺血再灌注大鼠心肺肾损伤保护作用的研究

刘佩仪 黄伟青 洪妙玲 武钊 文锐玲 郭兰英 郭伟 黄瑞娇

·论著·

DADLE对急性全脑缺血再灌注大鼠心肺肾损伤保护作用的研究

刘佩仪 黄伟青 洪妙玲 武钊 文锐玲 郭兰英 郭伟 黄瑞娇

目的通过二血管阻断加低血压法建立大鼠急性全脑缺血再灌注模型，探讨在脑缺血再灌注情况下DADLE对于心肺肾的保护作用。方法将50只SD大鼠随机分为5组：假手术组(Sham)、模型组(I/R)、DADLE处理组(根据不同剂量可分为2 mg/kg[A]、3 mg/kg[B]、5 mg/kg[C])。采用改良的二血管阻断加低血压法建立全脑缺血再灌注模型。手术后立即取心肺肾，常规HE染色观察其形态学改变。结果I/R组心肌细胞间有出血现象，心肌细胞有轻度萎缩,少量炎性细胞浸润；肺脏表现为肺泡间隔增宽，毛细血管扩张充血，肺胞腔内及血管周围中性粒细胞浸润，气管壁部分上皮脱落，肺胞腔及气管腔均有浆液渗出，肺大泡形成越来越多；肾脏表现为肾小球与肾间质有少量充血, 肾小球毛细血管未见明显扩张。DADLE处理组心肌出血减少并逐渐被吸收(P<0.05)；肺脏充血减轻，中性粒细胞浸润有所减少(P<0.05)；肾脏可见肾小球无明显充血肿胀，间质亦无明显瘀血。DADLE处理组组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论改良的二血管阻断加低血压法建立大鼠全脑缺血再灌注模型对心肺均有不同程度的损伤，但对肾脏影响较小，并且DADLE对全脑缺血再灌注大鼠心肺损伤有一定的保护作用，但与剂量无明显相关。

DADLE；全脑缺血再灌注；心肺肾损伤

目前有很多研究证实δ阿片受体激动剂DADLE对大鼠全脑缺血再灌损伤有保护作用[1], DADLE 成为近年来研究神经保护的领域中的热点。近年发现DADLE在急性缺血再灌注实验中, 可以提高组织氧利用率、维持组织氧代谢平衡从而减轻组织缺氧造成的能量代谢紊乱, 减少细胞和组织的损伤[4]。本研究通过建立大鼠全脑缺血再灌注模型，给予DADLE干预，从而探讨其在脑缺血损伤中对于心肺肾等重要脏器的保护作用，评估其应用价值。

1 资料与方法

1.1实验材料 DADLE(D-Ala2-D-Leu5-enkephali)分子式C29H39N507 购自美国Sigma公司，BL-420E生物机能实验系统由四川泰盟科技有限公司生产，24 g×19 mmY型留置针由威海洁瑞医用制品有限公司提供。

1.2动物及分组 SD大鼠50只，雌性，体重180～220 g，由广州中医药大学动物实验中心提供，合格证号SCXK(粤)2008-0020。于广州医学院实验动物中心喂养，实验前适应喂养1周。大鼠随机分为假手术组(Sham)、模型组(I/R)、DADLE处理组，其中DADLE处理组又分为2 mg/kg(A)、3 mg/kg(B)、5 mg/kg(C)三个亚组，每组各10只。

1.3二血管阻断加低血压建立大鼠全脑缺血再灌注模型 模型组(I/R)大鼠 2%戊巴比妥(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，取仰卧位固定。切开左侧大腿股部处皮肤，准确分离股动脉后采用静脉留置针行动脉插管，后以缝线固定，通过Y型留置针注射肝素60IU/kg达到全身肝素化。右侧股动脉以相同的方法行动脉插管，并与BL-420E生物机能实验系统连接，通过生物机能实验系统监测记录动脉血压。颈正中切口,分离双侧颈总动脉和左侧颈静脉，经左侧颈静脉插管建立体外给药途径。通过左侧股动脉插管回抽血液至平均动脉压达30～40 mm Hg，然后用微型动脉夹夹闭双侧颈总动脉，进入缺血期。缺血15 min后移去微型动脉夹去除双侧颈总动脉的夹闭，于左侧股动脉回输血液至血压达到正常(回输速度匀速且缓慢)，此为再灌注期，本实验再灌注期时间为120 min。DADLE处理组于再灌注前经由左侧颈静注射不同剂量的DADLE(A组2 mg/kg、B组3 mg/kg、C组 5 mg/kg)。Sham组除了不进行颈动脉夹闭、不抽血、不给药外，其余操作同前。

1.4HE标本的制备及染色观察 灌注120 min后，处死大鼠，断头放血，取心肺肾，经生理盐水漂洗后于4%多聚甲醛固定，脱水后石蜡包埋，行常规HE染色后观察其形态学改变。

1.5统计学分析 统计方法用t检验，数据采用SPSS 19.0统计学软件进行分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

图1 大鼠不同处理后心肺肾形态变化(HE，×400)

2.1全脑缺血再灌注大鼠心肌病理改变 见表1，从表1可见，I/R组病理表现均有较Sham组发生率增高的趋势，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。而DADLE处理组(包括A、B、C组)较I/R组病理表现有明显下降的趋势(除外炎性浸润)，两组差异有统计学意义(P<0.05)。而A、B、C组心肌病理异常发生率差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2全脑缺血再灌注大鼠肺脏病理改变 见表2，从表2可见，I/R组病理表现均有较Sham组发生率增高的趋势，两组差异有统计学意义(P<0.05)。而DADLE处理组(包括A、B、C组)较I/R组病理表现有明显下降的趋势(除外血管充血)，两组差异有统计学意义(P<0.05)。而A、B、C组肺脏病理异常发生率差异无统计学意义(P>0.05)。

注：与Sham组相比，*P<0.05；与I/R组相比，#P<0.05

病理表现Sham组I/R组A组B组C组合计例数101010101050正常81*3#4#3#19炎性浸润16*32416细胞间出血18*3#3#2#17间隔增宽29*2#3#4#21

表2 全脑缺血再灌注大鼠肺病理改变

注：与Sham组相比，*P<0.05；与I/R组相比，#P<0.05

2.3全脑缺血再灌注大鼠肾脏病理改变 I/R组肾脏表现为肾小球与肾间质有少量充血, 肾小球毛细血管未见明显扩张。DADLE处理组肾脏可见肾小球无明显充血肿胀，间质亦无明显瘀血。A、B、C组肾脏无明显病理异常。

3 讨论

心脏骤停复苏后引起急性脑组织不同程度的损伤, 而且可能还诱发其他重要脏器的损伤。本实验采用改良的二血管阻断加低血压法建立全脑缺血再灌注模型，给予不同剂量的DADLE干预，取心肺肾各脏器组织切片，经HE染色在光镜下观察到:

I/R组心肌细胞间有出血现象，心肌细胞有轻度萎缩,少量炎性细胞浸润；肺脏表现为肺泡间隔增宽，毛细血管扩张充血，肺胞腔内及血管周围中性粒细胞浸润，气管壁部分上皮脱落，肺胞腔及气管腔均有浆液渗出，肺大泡形成越来越多；肾脏表现为肾小球与肾间质有少量充血, 肾小球毛细血管未见明显扩张。DADLE处理组心肌出血减少并逐渐被吸收(P<0.05)；肺脏充血减轻，中性粒细胞浸润有所减少(P<0.05)；肾脏可见肾小球无明显充血肿胀，间质亦无明显瘀血。DADLE处理组组间差异无统计学意义(P>0.05)。

以上结果表明改良的二血管阻断加低血压法建立大鼠急性全脑缺血再灌注模型可对心肺均有不同程度的损伤，但对肾脏影响较小，并且DADLE对急性全脑缺血再灌注大鼠心肺损伤有一定的保护作用，与剂量无明显相关。因此，我们认为首次研究DADLE对全脑缺血再灌注大鼠心肺损伤有一定的保护作用是成功的。这将为今后的相关研究打下坚实的基础。

范红斌研究表明脑缺血再灌注大鼠肾脏形态学检查的结果最严重的是24 h,但其采用线栓法[7]。而本研究采用改良的二血管阻断加低血压法，以血液流变学观点来分析，此法更符合血液流变学的要求。采用较为柔和的人为作用，在造成急性脑缺血的同时，可能参与维持了某些器官全部或部分双重血管的开放，基本保证了血液在全身器官的方向性，因此肾脏损伤较小，这给临床肾移植提供参考价值。但是，关于DADLE对肾脏是否有保护作用仍需进一步研究。

阿片受体分为MOR(M opiate receptors，MOR)、δ型阿片受体(δopiate receptors，DOR)、K型阿片受体(K opiate recetors，KOR)3种亚型[5]。有研究人员发现DOR系统可能参与缺血缺氧神经元的保护和神经发生，近来有实验表明δ受体激动剂能显著改善缺血心肌的舒张功能，对缺血心肌有保护作用，同时可能通过多种机制抗神经元缺氧损伤作用[6]。Su发现,与冬眠诱导促发因子(hibernation induction trigger,HIT)一样,δ阿片受体激动剂DADLE同样可以诱导冬眠,并可延长肺、肾脏的存活期。国内有关DADLE的研究主要是针对缺血缺氧神经元的保护，而对其他远隔脏器的保护作用尚无相关的基础研究。本研究探讨在脑缺血再灌注情况下DADLE对于心肺肾的保护作用是国内首次。这给人们寻找治疗临床各种致脑缺血缺氧损伤疾病用药提供了新的思路。

[1] Liu WY, Jin ZX. Opioid receptor induced myocardial hibernating and myocardial protection. Chin J Ext Circ,2004,2(1):53-55.

[2] 宿英英，车林海,等.脑卒中与急性肺损伤的临床研究.中华老年心脑血管病杂志，2000，2(3)：180-182.

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[4] 唐成武、鲍鹰,等.δ阿片受体激动剂对脓毒症大鼠肺功能的保护作用.华中科技大学学 报(医学版),2009,38(6):796-799.

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[7] 范红斌,等.脑缺血再灌注时心肾损伤的形态学变化及代谢特征.中国老年学杂志,2009，8(27)，2039-2041.

ProtectiveeffectofDADLEonacutecerebralischemiareperfusioninratheartlungkidneyinjury

LIUPei-yi，HUANGWei-qing，HONGMiao-ling，WUZhao,etal.

TheFirstAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalCollegeGuangzhou510120,China

ObjectiveThrough two vessels occlusion add hypotension to establish the global cerebral ischemia/reperfusion(I/R)model，To dicuss the protective effects with DADLE on heart,lung and renal injury after the global cerebral ischemia/reperfusion.MethodsIn total, 50 SD rats were randomly divided into 5 groups:a sham-operated, a I/R and three DADLE-treated(different drug doses:2 mg/kg[A], 3 mg/kg[B] and 5 mg/kg[C]).Use improvement of two vessels occlusion add hypotension to establish the global cerebral ischemia/reperfusion model in rats.The morphology changes of heart,lung and renal were evaluated by hematoxylin-eosin staining method.ResultsOn I/R group,the heart performance for bleeding phenomenon and atrophy in myocardial cells and infiltrating by inflammatory cells;the lung performance for broadening on the alveolar interval,infiltrating by inflammatory cells;forming more and more lung bubbles;the renal performance for a few congestion on the glomerular and interstitial.DADLE-treated group bleeding less and absorbed gradually into the myocardial cells(P<0.05);less bleeding and infiltrating by inflammatory cells among the lung;the renal had not change aprecrably obviously.There were no obvious difference on DADLE-treated groups(P>0.05).ConclusionThere are different degrees of injury on the heart and lung but renal by the improvement of two vessels occlusion add hypotension to establish the global cerebral ischemia/reperfusion model in rats.And DADLE may be have some protective effects on heart and lung injury after the global cerebral ischemia/reperfusion in rats,but it isn’t related to dose obviously.

DADLE; Global cerebral ischemia/reperfusion; Heart, lung and renal injury; HE staining

2011年广州市大学生科技创新实践项目(项目编号：1057011004)；广州市医药卫生科技项目(项目编号：201102A213152)

510120 广州医学院第一附属医院

黄伟青