KLK14在宫颈癌组织中的表达及其意义

李巧云 闻立红 颜秋梅

KLK14在宫颈癌组织中的表达及其意义

李巧云 闻立红 颜秋梅

目的探讨KLK14蛋白宫颈癌中的表达及与临床病理关系。方法应用免疫组织化学法SP检测10例正常宫颈14例慢性宫颈炎48宫颈癌组织中KLK14蛋白的表达。应用半定量逆转录聚合酶链反应法RT-PCR检测25例宫颈鳞癌及10例正常宫颈组织中KLK14 mRNA的表达。结果KLK14蛋白在48例宫颈癌中阳性率72.9%，正常宫颈20%，慢性宫颈炎14.3%,三者相比差异有统计学意义，KLK14蛋白阳性率与肿瘤临床分期，病理学相关(P<0.05),与年龄组织学分级淋巴转移无关(P>0.05)。KLK14 mRNA在宫颈癌相对表达量高于正常宫颈组织。结论KLK14表达参与宫颈癌的发生发展。

宫颈鳞癌；人激肽释放酶14；逆转录聚合酶链反应

宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，疗效总体生存率不高，经常地进行评估是必须的，激肽释放酶(kallikrein，KLK)家族是目前被研究与恶性肿瘤表达相关的基因家族， 参与体内多种生理病理过程。KLK14是KLK家族中一员，拟采用SP及RT-PCR研究宫颈癌细胞内KLK14蛋白及mRNA的表达，探讨其在宫颈癌中发生发展意义及与临床病理的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 48例宫颈癌取自2007年1月至2010年1月我院手术切除标本，正常宫颈10例，慢性宫颈炎14例来源于同期子宫切除术标本，所有标本部分存于-80℃冰箱中用RNA提取，另一部分用福尔马林固定石蜡包埋进行SP检测。患者年龄29～71岁，中位年龄43.5岁。宫颈癌病理：鳞状细胞癌43例，腺癌5例，分期：I 期21例,Ⅱ期13例，Ⅲ期9例，IV期5例。分级：G112例，G220例，G316例。淋巴转移者17例，无淋巴转移者31例。所有患者均为初发者，术前均未接受过放化疗治疗。同期取正常宫颈组织10例和25例宫颈鳞癌行RT-PCR实验。

1.2主要试剂山羊抗人KLK14多克隆抗体(Santn Cruz公司)和SP-9003三步法试剂盒(兔抗羊，北京中杉公司).Trizol试剂购自invitrogen公司，AMV逆转录试剂盒(AMV3500)购自promega公司。Ex-Taq酶试剂盒购自大连宝生物公司。KLK14及β-actin引物由上海生工生物有限公司合成。RT-PCR仪器为bio-rid公司产品。

1.3方法

1.3.1SP法 所有组织标本固定石蜡包埋，4 μm厚连续切片，每批染色均设阴性和阳性对照。阴性对照采用磷酸盐缓冲液(PBS) 代替一抗，阳性对照取已知KLK蛋白表达阳性的乳腺癌组织的石蜡切片。

1.3.2RT-PCR法 采用Trizol一步法提取组织总RNA，取1 μg总RNA，用AMV逆转录试剂盒进行反转录获得cDNA(逆转录反应参照试剂盒说明进行)，取2 μg cDNA为模板进行PCR反应，KLK14上游引物序列为5’-CCGCAGACTTCACCACTCG TAT-3’，下游引物序列为5’-AGGTGTGAGGCAGGCGIAAF-3’，用β-actin作为内参照，上游引物为5’-TGGCAGGACTTCA GA-3’，下游引物5’-AGTGGCTAGAAGTTCACC-3,[1]。PCR反应条件为：95℃预变性4 min, 95℃变性30 sec,56℃退火30 sec,72℃延伸30 sec，35个循环后最后72℃延伸5 min,所有的反应体系均做2管，作为平行对照。在实验过程中，每次结束均将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，检测扩增产物长度。紫外分光光度计检测RNA纯度及浓度。

1.4阳性结果判定标准免疫组织化学 参照文献[2]制订。KLK14蛋白定位细胞浆，显示胞浆为淡黄色或棕黄色者为阳性细胞，凡显色强度与背景无明显差异者为阴性，而显色强度高于背景为阳性表达，将阳性细胞按其数量及显色强度分为3级，表达阳性细胞数小于10%，染色强度为弱阳性或仅个别细胞呈中至强阳性染色，即为表达弱阳性(+)；阳性细胞为60%以上，多数细胞呈黄色或棕黄色染色，即表达强阳性+++；表达的阳性细胞数及强度介于上述二者之间为阳性(++)。

1.5统计学方法 采用SPSS 11.0统计软件。各计量资料比较应用t检验(经正态性检验和方差齐性检验)，KLK14表达与临床参数关系采用χ2检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1sP染色显示KLK14蛋白定位于宫颈上皮细胞浆，阳性表达率简表1，三者相比差异有统计学意义

2.2KLK14蛋白表达与宫颈癌病理的关系(见表2)KLK14蛋白的表达与临床分期、病理学有关，与年龄、组织学分级和淋巴结转移无。

图1 宫颈鳞状细胞癌KLK14蛋白++阳性表达(×200)

组织类型例数KLK14-+χ2值P值正常108(80)2(20)*炎症1412(85.7)2(14.3)*恶性4813(27.1)35(72.9)20.4680.001

表2 KLK14蛋白与宫颈癌临床病理因素间的关系(*表示校正卡方检验)

2.3KLK14 mRNA在不同宫颈组织中的表达 RT-PCR产物KLK14及β-actin PCR产物片断长度为624 bp，455bp。10例正常宫颈组织KLKmRNA表达产物的相对表达量为0.30～0.95之间，25宫颈鳞癌 的在为0.88～1.81之间，KLK14 mRNA在宫颈鳞癌组织中的表达显著高于正常宫颈组织，差异具有统计学意义(t=-8.582,P<0.01)。

2.4KLK14蛋白与KLK14 mRNA表达的相关性 宫颈鳞癌中KLK14 mRNA的基因表达率很高，与正常宫颈组织表达量之间的差别有统计学意义(P<0.01)，这说明KLK14 mRNA水平和蛋白水平表达有一致性。

图2 KLK14 mRNA在宫颈正常组织和宫颈癌组织中的表达

1.DNA分子量标准；2.2,3正常宫颈组织,3.4,5，6：宫颈鳞癌

3 讨论

3.1KLK基因家族及KLK14的结构特点及蛋白生物学功能 目前发现肿瘤的发展是一个多级式过程，肿瘤细胞是从基本位点脱落通过血液运输播散至远处器官产生肿瘤转移。临床试验表明恶性肿瘤细胞的发生依赖恶性肿瘤细胞合成分泌的蛋白水解酶穿透细胞基底膜侵袭邻近组织，现和肿瘤进展密切相关的胞外蛋白酶有基质金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶[3]。人激肽释放酶KLK(kallikrein)是一组大的丝氨酸蛋白酶家族，位于19q13.4染色体上，由15个成员组成， 通过激肽释放，降解胰岛素原LDL,血管紧张素，精原素等生物学功能参与肿瘤的发生发展及肿瘤侵润转移等。

KLK14是KLK家族中一员，全长6439bp，有三联体残基表明KLK14具有胰蛋白酶活性，翻译分泌性蛋白[4]。 KLK14基因及蛋白与妇科肿瘤，消化道肿瘤，乳腺癌，肺癌等疾病发生发展有重要关系[4]。

3.2KLK14基因及蛋白在不同宫颈组织的表达意义 本实验研究了KLK14蛋白在宫颈细胞中表达，发现 KLK14在正常宫颈，宫颈炎性上皮细胞内表达率较低，在宫颈癌中呈现高表达，与KLK14蛋白在卵巢癌，KLK7、KLK8在宫颈癌中高表达一致[5]，通过对KLK14蛋白与宫颈癌临床病理特征分析，发现KLK14蛋白的表达与宫颈癌的年龄及组织学分级无关，与临床分期，病理类型相关，Ⅲ/Ⅳ期患者阳性率高于Ⅰ/Ⅱ期，表明KLK14蛋白的表达一定程度上与宫颈癌的临床进展相关，本组研究也发现KLK14 mRNA在宫颈癌中高表达，与正常宫颈组织表达量之间的差别有统计学意义(P<0.01)，这说明KLK14 MRNA水平和蛋白水平表达有一致性。由此推测KLK14可能与宫颈癌潜在生物学行为密切相关，可能会是一个有价值的肿瘤标记物。但因样本量偏小，KLK14与宫颈癌的淋巴转移之间的关系还有待进一步研究。

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ExpressionofKLK14proteinincervicalcance

LIQiao-yun,WENLi-hong,YANQiu-mei.

DepartmentofObstetricsandGynecology,TheFifthAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity450052

ObjectiveTo analyse the expression of klk14 in cervical cancer and the results were studied in correlation with clincopa thological characteristics of patients.MethodsThe expression of KLK14 protein was analysed by immunohistochemistry in paraffin embedded 48 cervical carcinomas, 14 chronic cervicitis and 10 normal cervical tissues. The expression of KLK14 mRNA was determined by RT-PCR in 25 cases of cervical squamous carcinomas and 10 cases of normal cervical tissues.ResultsThe expression of KLK14 protein was observed in cervix tissue, chronic cervicitis and cervical cancer, respectively 20%, 14.3% and 72.9%, there was a stastistical significance. The positive expession of the KLK14 protein was significantly related to clinical stage, pathological type (P<0.05), and not related to age,histological grade,lymph node metastasis. (P>0.05) The mRNA expression of KLK14 in squamous carcinomas are more higher in cervical normal tissues.ConclusionThe expression of KLK14 protein was related to the occurrence and development of cervical squamous carcinomas

Cervical squamous carcinomas； KLK14 protein； RT-PCR

河南省卫生厅课题项目(项目编号：2008046)

450052 郑州大学第五附属医院