用ESI-TOF-MS分型技术检测线粒体DNA高变区碱基组成的多态性

李 莉，柳 燕，林 源，赵珍敏

（司法部司法鉴定科学技术研究所 上海市法医学重点实验室，上海200063）

线粒体DNA（mtDNA）在法医生物学鉴定中具有独特价值，可用于母系关系检验，亦能作为辅助检测手段用于同胞关系鉴定等，在亲权鉴定中发挥重要作用。另外，由于线粒体DNA在细胞内呈现多拷贝状态，可在核DNA检验难以成功时尝试用于陈旧骨、牙、毛干等检材的检验[1-2]，在个体识别中也发挥特殊作用。

mtDNA基因组的控制区（D环）存在两个多态性区域：高变区Ⅰ（16024～16365nt）和高变区Ⅱ（73～340nt）。Sanger测序即双脱氧末端终止法[3-4]是法医DNA实验室通用的检测高变区核苷酸序列的方法。但是，测序方法比较繁琐，且遇到DNA模板序列中有多个碱基C相连时（P olyC）往往导致测序结果难以判读；其次，由于当前通用的测序手段所得的信息量不大，人群中的无关个体极有可能具有相同的检测结果，因而在个体识别中的价值比较有限。目前，有学者报道了线粒体基因组全测序的价值[5]，该法所获得的信息量大，但是其成本较高，尚不宜推广使用。

本研究采用电喷雾飞行时间质谱（ESI-TOF-MS）[6]技术检测mtDNA，该法分型准确、不受模板序列中Poly C的影响，通过碱基组成反映样本mtDNA D环高变区的特征，结果报告方式灵活，在法医学上具有良好的应用前景[7-8]。本文用该技术检测了线粒体DNA高变区碱基组成在华东汉族群体的多态性，并通过实际案例的应用探讨了该技术的应用价值。

1 材料与方法

1.1 样本

在知情同意基础上，采集华东地区12名汉族无关个体枸橼酸钠抗凝外周血，200μL/人。

1.2 方法

1.2.1 DNA抽提

取枸橼酸钠抗凝血200μL，采用微量血液DNA抽提试剂盒（QIAamp Mini Blood试剂盒，德国Qiagen公司）提取基因组DNA。

1.2.2 mtDNA检测

通过Abbott公司提供PLEX-ID平台的技术服务完成样本mtDNA的检测。该平台使用24对引物[7]，采用8个三重PCR扩增体系[1，7]联合电喷雾离子化飞行质谱技术（ESI-TOFMS）检测mtDNA高变区Ⅰ和高变区Ⅱ各12个区段的碱基组成（即A、G、C、T四种碱基的数量），相邻的两个区段之间有2～22个碱基的重叠。整个技术流程包括PCR扩增、纯化和PCR产物在PLEX-ID平台的分型[6]。为了验证结果的准确性，除了设置已知分型结果（该结果已先期经过测序验证）的样本作为阳性对照之外，还从群体抽取2个样本同时用测序平台和PLEX-ID平台进行检测；对于PLEX-ID平台的结果，既报告碱基组成信息，亦通过后台数据库的比对报告其核苷酸序列特征，将结果进行比对，考察一致性。

为了考察PLEX-ID平台的实际应用价值，选择了一个特殊的母子关系鉴定案例，该案例中的被检母亲与被检男孩经D19S433等46个STR基因座的检测，均未能排除亲子关系，经用汉族群体的等位基因分布频率计算累积母权指数（CMI），发现似然比率高达3.3×1013。但是，经调查，被检母亲与男孩是事实上的姑侄关系。本文用PLEX-ID平台对该案例的检材进行了mtDNA的补充检测。

3 结果

3.1 质控结果

检测过程所设置的阳性结果正确。高变区Ⅱ309-315nt是碱基C集中分布、通常测序最难以分辨的区域，但PLEX-ID平台检测的结果表明，该区域质谱分辨效果理想。从群体抽取的2个样本同时用测序平台和PLEX-ID平台进行检测，结果一致。

3.2 mtDNA高变区碱基组成的多样性

经对华东汉族12名无关个体进行检测，获得mtDNA高变区碱基组成的多样性信息，各类型的分布频率见表1。

表1 高变区24个区段各种碱基组成类型的分布频率

续表1

高变区Ⅰ（检测范围为15924～16428nt）的 12个片段中，8个区段的碱基组成表现出多态性，4个区段则未检见多态性。

mtDNA高变区Ⅱ（检测范围为31～576nt）的12个片段中，10个区段的碱基组成表现出多态性，仅2个区段）未检见多态性。

3.3 单核苷酸多态性（SNP）和片段长度多态性

高变区Ⅰ的8个多态性区域的碱基组成信息反映出区段内所存在的单核苷酸多态性SNP和（或）长度多态性（见表2）。依据碱基组成信息推断，扩增的片段（15924～15985nt）存在等位基因为G/A的SNP位点，16124～16201nt区域同时检见了4个SNP位点（T/C、G/A、G/C、C/A）和长度多态性。

与高变区Ⅰ类似，高变区Ⅱ的10个多态性区域的碱基组成信息也反映出区段内所存在的单核苷酸多态性SNP和（或）长度多态性（见表2）。依据碱基组成信息推断，31～114nt区域存在长度多态性；103～267nt区域存在序列多态性（可检见T/C、C/A和G/A等SNP位点）；234～340nt同时存在序列多态性（可检见C/A、G/A等SNP位点）和Poly C长度多态性。

3.4 案例应用

将ESI-TOF-MS分型技术应用于上述特殊母子关系鉴定案件，发现被检母亲和男孩在线粒体DNA高变区Ⅰ的6个区段碱基组成不同（16102～16224nt，16130 ～16224nt、16154 ～16268nt、16231 ～16338nt、16256～16366nt、16318～16402nt），在线粒体DNA高变区Ⅱ亦有6个区段碱基组成不同（83～187nt、113～245nt、 204～330nt、 239～363nt、 262～390nt、464～603nt），因此排除被检母亲为男孩的生物学母亲。

表2 高变区24个区段的序列多态性和长度多态性

4 讨论

4.1 ESI-TOF-MS检测方法的特点

本文报道了分析mtDNA的新方法，该检测技术是多重PCR和ESI-TOF-MS的结合，分型平台是美国Abbott公司的PLEX-ID。该平台虽然存在缺憾，例如：对于每个样本通过8个三重PCR体系完成PCR扩增，要求DNA溶液的体积不少于50μL，因此可能不适用于脱落细胞类（“接触”DNA）的分析，且检测成本昂贵，对设备要求较高，不利于推广应用。但是，和传统的测序技术相比，这种分型技术平台具有如下优势：（1）扩增子短小。使用24对引物，所扩增的片段长度为80～120bp，由于扩增片段小，且方法的灵敏度高（每个PCR扩增体系中DNA最低量为25pg），故适用于降解检材的分型；（2）可读取信息的范围宽广。对于高变区Ⅰ，Sanger测序技术可读取信息的范围一般为16024～16365nt，但ESI-TOF-MS可读取信息的范围为 15924～16428nt；对于高变区Ⅱ，Sanger测序技术可读取信息的范围一般为73～340nt，但ESI-TOF-MS可读取信息的范围为31～576nt，高变区Ⅰ2901号、2925号、2889号引物的扩增子信息和高变区Ⅱ2902号、2910号、2916号、2912号、2913号引物的扩增子信息均是Sanger测序技术所不能获取的。（3）该平台检测结果准确。由于反应体系中加有13C-dGTP，使分子量差异不大的碱基（G-A，C-T）在质谱上均得以正确分辨。（4）不受序列中Poly C的影响。据报道[11]，当高变区存在9个以上的碱基C时，Sanger测序反应易受到影响，使得测序信号混乱和中断，碱基识别亦会发生错误，此时只能通过双向序列拼接才能获得其全序列。但是，遇到Poly C情形时，PLEX-ID平台依旧能够获取关于碱基组成的可靠信息，例如高变区Ⅱ309～315nt是 Poly C所在区域，PLEX-ID平台 2908号引物（扩增范围为 234～313nt）、2907号引物（扩增范围为263～340nt）和2923号引物（扩增范围为289～367nt）均能准确无误地检出扩增区域内的碱基组成。（5）检测过程易于质控。在该平台上，样本准备、PCR产物纯化、结果判读等操作均实现了自动化，可有效地避免或减少人为差错。

表3 血样ESI-TOF-MS检测结果的两种判读方式（示例）

4.2 ESI-TOF-MS检测结果的判读方式

表3示一血样的检测结果。mtDNA经ESI-TOFMS检测后，直接读取24个区段的碱基组成信息（包含序列异质性和长度异质性），但为了便于不同法医生物学实验室进行结果比对，可以利用该平台业已建立的数据库，报告高变区的核苷酸序列特征，即通过与Anderson标准序列（又称修正的剑桥参考序列rCRS，在基因组数据库中的编号为NC_012920）比对，标出与标准序列不同的碱基为特征点。对于核苷酸多态性点，结果输出格式为：碱基定位+空格+测定序列的碱基，如：40 A；对于缺失情形，结果输出格式为：碱基定位 +空格 + “-”，如：40-；对于插入1个碱基的情形，结果输出格式为：标记点（插入碱基左侧第一个碱基的定位）+小数点 +1+空格+插入的碱基，如40.1 A，有2个以上插入的情形则依次报告为40.2 A、40.3 A等格式。该结果输出方式符合国际标准的要求。

4.3 mtDNA碱基组成的多态性

经对华东汉族12名无关个体进行检测，在mtDNA的D环区，高变区Ⅰ的12个片段中检见8个区段的碱基组成表现出多态性，高变区Ⅱ的12个片段中检见10个区段表现出多态性，反映出这些区段内存在SNP位点和长度多态性，其中SNP位点有碱基颠换（C-A，C-G）、替换（G-A， T-C）等情形，这与学者们Sanger测序的结果相符。例如，在高变区Ⅰ，Sanger测序平台已经发现 16256、16261、16266、16278、16290、16291、16294、16295、16296 和 16301 等位点存在T/C点突变，PLEX平台2892号引物的扩增范围为16254～16301，其碱基组成的检测结果正好反映出该区域存在SNP位点T/C（见表2）；在高变区Ⅱ，Sanger测序平台已经发现 146、150、151、152、182、194、195、198、199、204 等位点具有 T/C 多态性，188、200、207、210等位点具有G/A多态性，PLEX平台2904号引物的扩增范围为103～162nt，2905号引物的扩增范围为138～217nt，这两个区段在碱基组成的多样性方面正好反映出 103～217区域存在 T/C、G/A等 SNP位点（见表2）。但是，由于样本量不大，可能漏检了一些多态情形，比如：在2908号引物的扩增区域，人群中可能还分布有A29 G6 C30 T16；在2913号引物的扩增区域，人群中可能分布有A27 G6 C47 T5和A27 G6 C48 T5等，但本次样本中未能检出。

结果表明，所检验个体的mtDNA D环区均没有相同的碱基组成，且18个区段在个体之间表现出差异，经统计各个区段碱基组成类型在群体中的分布频率，发现有些情形较为多见，如178～267nt区域A32 G15 C14 T29的类型在人群中的分布频率高达38.47%，而有些情形极为稀少，如16157～16201nt区域A16 G1 C20 T7类型的分布频率低至5.55%，提示mtDNA碱基组成的分析方法在个体识别中可能具有重要价值和作用。

4.4 ESI-TOF-MS分型技术在实际案例中的应用

Rebecca Howard等学者在2013年报道了ESITOF-MS分型技术成功地用于第一次世界大战中250名士兵遗骨DNA检测的结果[1]，显示出该技术在陈旧、降解检材mtDNA分型方面的独到作用。本文作者则将该分型技术应用于一起极其特殊的母子关系鉴定案件，发现mtDNA碱基组成的分析结果可作为常染色体STR分型的一个很好的补充[10]。该案例中的被检母亲与被检男孩实为姑侄关系，经D19S433等46个STR基因座的检测，均未能排除非母，但经PLEXID平台补充检测，发现被检母亲和男孩在线粒体DNA高变区Ⅰ与高变区Ⅱ各有6个区段碱基组成不同，因此排除被检母亲为男孩的生物学母亲。该检测结果后来得到了传统测序方法的验证，其鉴定结论与常染色体SNP和X染色体STR分型结论[9-10]一致，从而避免了出具错误的鉴定意见。

总之，本研究探讨了ESI-TOF-MS技术平台检测mtDNA碱基组成信息的可行性，分析了高变区24个区段在华东汉族群体的多态性，通过实际案例的应用证实了该平台在法医生物学上的应用价值。

致谢

感谢Abbott公司为本研究工作提供PLEX平台和法医学mtDNA检测试剂盒，感谢Steve Hofstadler和Tom Hall博士在样本检测和数据分析中提供的帮助。

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