α-突触核蛋白和葡糖脑苷脂酶在食蟹猴不同脑区的表达

弥 娜 刘光伟 李 昕 李尧华 于 顺

(首都医科大学宣武医院神经生物学研究室 北京市老年病医疗研究中心分子诊断实验室 教育部神经变性病重点实验室，北京100053)

α-突触核蛋白(α-synuclein，α-Syn)的异常聚集被认为在帕金森病(Parkinson’s disease，PD)的发病中起重要作用［1-3］。α-Syn在神经元的积聚和聚集与其降解通路发生障碍有关。最新研究［4-6］表明，α-Syn的降解主要通过伴侣分子介导的自噬(chaperonemediated autophagy，CMA)进行。CMA是溶酶体自噬系统中的一种选择性的胞质蛋白降解途径。最新的研究［7-8］结果表明，CMA对α-Syn的降解需要葡糖脑苷脂酶(glucocerebrosidase，GBA)的正常活性。能够引起戈谢病的GBA失功能突变可以增加PD及相关突触核蛋白病(synucleinopathy)的患病风险。在戈谢病小鼠模型，伴随GBA活性的严重下降，小鼠不同脑区出现明显的α-Syn聚集［9］。而下调GBA活性可以导致溶酶体蛋白降解能力下降以及随后的α-Syn聚集和依赖于α-Syn聚集的神经毒性作用［10］。已知，PD的神经病理变化具有明显的部位选择性。对纹状体和小脑的分析结果表明，PD患者纹状体的线粒体中的α-Syn水平显著高于小脑的线粒体的α-Syn水平，并伴有线粒体复合酶I活性的降低，后者是PD患者线粒体变化的重要特征［11］。我们推测，α-Syn在局部脑组织的聚集可能与该部位CMA的活性有关，其中GBA在局部的表达水平和活性可能影响局部α-Syn含量。在本研究中，我们以非人灵长类动物食蟹猴为模型，观察PD敏感脑区纹状体和PD非敏感脑区小脑皮质α-Syn与CMA降解有关的蛋白质GBA的表达及其相互关系。

1 材料和方法

1.1 实验材料

健康食蟹猴(3～4岁)5只，购自广西雄森灵长类动物养殖中心，实验动物许可证号:SYXK桂2009－0006，所有动物均有详细出生档案和检疫证书，动物研究方案经实验动物福利委员会(Institutional Aniamal Care and Use Committee，IACUC)认定批准。鼠抗人α-Syn单克隆抗体3D5由本室制备［12］，兔抗人GBA单克隆抗体(Epitomics公司)，生物素标记山羊抗兔IgG、生物素标记山羊抗小鼠IgG、链霉亲和素标记辣根过氧化物酶、FITC标记山羊抗兔IgG(购自中杉公司)，streptavidin-Cy3(Sigma公司)，β-葡糖脑苷脂酶活性检测试剂盒(BioAssay Systems公司)，BCA蛋白质定量试剂盒(PIERCE Biotech公司)。

1.2 方法

1.2.1 Western blotting方法

将猴脑组织在组织裂解液［13］中研磨、裂解，12 000 g于4℃离心30 min。收取上清获得全细胞匀浆。BCA法测定蛋白浓度。按每个泳道80 μg总蛋白上样，SDS-PAGE分离蛋白质，半干法转移蛋白质至PVDF膜。PVDF膜 首 先 分 别 与 抗 α-Syn(3D5)(1 ∶2 000)及抗 GBA(1 ∶5 000)抗体反应过夜，然后与相应的辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠或抗兔IgG(1∶5 000)室温孵育1 h。辣根过氧化物酶活性用ECL试剂盒检测。

1.2.2 葡糖脑苷脂酶活性分析

按照GBA酶活性检测试剂盒提供的方法，将上述方法制备的脑匀浆样品加入96孔板中，再分别加入超纯水和酶活性试剂盒中的标准液、底物液、检测缓冲液，酶标仪测定在405 nm波长的反应前(0 min)和反应30 min后的吸光度值。GBA酶活性=［(OD30min－OD0min)/(OD标准液－OD水)］×250(U/L)。

1.2.3 免疫组织化学法

将猴脑组织制成石蜡切片，依次进行脱蜡、柠檬酸盐缓冲液抗原热修复、PBST通透性处理和正常羊血清封闭，然后分别与抗α-Syn单克隆抗体3D5(1∶200)和抗GBA(1∶200)抗体室温反应过夜，与生物素标记山羊抗鼠或山羊抗兔IgG(1∶200)室温反应2 h，最后与链霉亲和素标记辣根过氧化物酶(1∶100)室温反应1 h，DAB显色。切片经脱水透明、封片后，在显微镜下观察结果。

1.2.4 免疫荧光双重标记法

将切片依次经过脱蜡、抗原热修复、通透性处理和正常羊血清封闭后，与抗GBA(1∶200)+抗α-Syn单克隆抗体3D5(1∶200)室温反应过夜，与生物素标记山羊抗小鼠IgG(1∶100)室温反应1 h，最后与FITC标记山羊抗兔IgG(1:100)和 streptavidin-Cy3(1∶200)室温避光反应1 h，DAPI染核封片，荧光共聚焦显微镜观察结果。

1.3 统计学方法

5只动物，每只动物重复实验3次。采用SPSS17.0软件对实验数据进行统计分析。所有数据用均数±标准差(±s)表示，组间比较用配对样本t检验进行分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 α-Syn在纹状体和小脑的表达

免疫组织化学结果显示，α-Syn在纹状体和小脑部位均有表达。α-Syn免疫活性物质呈细小的颗粒状，主要存在于神经末梢中，仅有少数神经元胞体呈α-Syn阳性反应(图1A)。Western blotting结果显示，α-Syn在纹状体的表达量明显高于小脑(图1B)，差异有统计学意义(P＜0.01)(图1C)。

2.2 GBA在纹状体和小脑的表达

免疫组织化学结果显示，GBA在纹状体和小脑部位均有表达。GBA免疫活性物质呈细小的颗粒状存在于神经元的胞质中，但也有少量颗粒状的阳性结构散在分布，这些阳性结构是GBA免疫反应阳性的神经末梢(图2A)。Western blotting结果显示，GBA在纹状体的表达量低于小脑(图2B)，且二者的差异均有统计学意义(P＜0.01)(图2C)。

2.3 α-Syn和GBA在纹状体和小脑的共定位

免疫荧光双重标记显示，在纹状体和小脑浦肯野细胞层和颗粒细胞层，均有GBA免疫反应阳性物质(绿色荧光)与α-Syn免疫反应阳性物质 (红色荧光)重叠。二者的重叠不仅见于神经元的胞体，也见于呈颗粒状分布的神经末梢(图3)。

2.4 GBA在纹状体和小脑的活性

我们分别测定了纹状体和小脑提取物中的GBA的活性。结果表明，纹状体的GBA活性明显低于小脑，二者的差异有统计学意义(P＜0.05)(图4)。

图3 α-Syn和GBA在纹状体和小脑的共定位Fig.3 Colocalization of α-Syn and GBA in striatum and cerebellum

图4 GBA在纹状体和小脑的活性Fig.4 Enzyme activity assay of GBA in striatum and cerebellum

3 讨论

已知，GBA是PD的风险基因，分子遗传学研究［14］表明，PD患者的GBA基因突变率明显高于正常对照。编码GBA的基因突变以及由此引起的神经鞘磷脂代谢改变与PD的发病有关［15-16］。GBA基因突变后通过削弱溶酶体的蛋白降解能力而引起α-Syn和葡糖脑苷脂(GBA底物)积聚，后者通过直接稳定α-Syn寡聚中间体而影响其在神经细胞的积聚［10］。本研究结果表明，PD易感脑区纹状体的α-Syn水平高于非易感脑区小脑。相反，参与α-Syn降解的GBA的水平和酶活性在纹状体却低于小脑。鉴于GBA参与α-Syn的降解，其在纹状体部位含量的降低和活性低下很可能是纹状体部位α-Syn含量较高的原因。

已知，α-Syn是一种易于聚集的蛋白质，其聚集依赖于其局部浓度［17］。因此，α-Syn在纹状体含量较高是导致该部位α-Syn易于聚集的原因。有文献［7］表明，α-Syn水平增高可以抑制GBA在细胞内的转运，导致溶酶体的GBA活性下降。

本文的研究结果提示，除了遗传因素导致GBA突变外，GBA在正常脑组织不同部位表达水平和活性的差异很可能是局部脑组织α-Syn含量不同的原因。纹状体由于GBA的含量和活性较低，导致α-Syn在该部位的降解速度缓慢，从而导致其在细胞内积聚和聚集。这可能是纹状体在PD患者易于受累的原因之一。然而在正常情况下，聚集的α-Syn含量尚不足以达到致病水平，某些遗传和环境因素可能加速α-Syn的聚集，从而诱发帕金森病。

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