HPLC法测定卷柏及其炮制品中穗花杉双黄酮的含量

吴彩霞，杨宇婷，康文艺*

1河南大学中药研究所，开封 475004;2河南省疾病控制中心，郑州 450003

卷柏为蕨类植物门卷柏科Selaginellaceae卷柏属植物，约有700种，广泛分布于全世界。我国约有50种，分布全国各地，主产于湖南、福建、四川、陕西、江西、浙江等地。春秋两季采挖，以春季采挖者为最佳［1］。2010年版《中华人民共和国药典》收载了卷柏Selaginella tamariscina(Beauv.)Spring或垫状卷柏 S．puluinata(Hook.et Gret.)Spring全草入药［2］。卷柏始载于《神农本草经》列为上品性味辛、平。具有活血通经之功效。用于经闭痛经、瘤瘦痞块、跌打损伤等症。卷柏炭能化瘀止血，用于吐血、崩漏、便血、脱肛等症。近年来对卷柏的化学成分，药效等进行了大量的研究。卷柏的主要化学成分:黄酮类如:芹菜素、穗花杉双黄酮、扁柏双黄酮等;酚类;生物碱;有机酸等。卷柏的药理作用主要有:增强免疫和抗肿瘤;缩短凝血时间升高血小板;抗菌抗炎;镇痛镇静等［3-6］。

近年来，卷柏炮制方面的文献报道主要针对炮制前后卷柏的化学成分和药理作用的变化，未见对炮制前后卷柏中穗花杉双黄酮的含量变化的研究。本课题组对卷柏进行了持续的研究［7-9］，在此基础上，首次采用HPLC法对卷柏生品、焦卷柏和卷柏炭中穗花杉双黄酮的含量进行检测和分析，探讨炮制对卷柏中穗花杉双黄酮含量的影响，为科学、合理的使用该类药材提供依据。

1 仪器与材料

岛津液相色谱仪 LC-2010CHT，自动进样器，Class-VP工作站，四元低压梯度泵，SPD-10AVP紫外-可见检测器;KQ3200型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司);101型电热鼓风干燥箱(北京中兴伟业仪器有限公司)。

穗花杉双黄酮对照品(自制，纯度＞98%);甲醇为色谱纯，水、磷酸为分析纯;卷柏于2007年7月采集于贵州都匀，经河南大学中药研究所生药教研室李昌勤副教授鉴定为卷柏科植物卷柏Selaginella tamariscina(Beauv.)Spring的干燥全草。

2 实验方法

2.1 药材的炮制［9-12］

卷柏生品:取卷柏拣去杂质，除去残根，清水洗净，切段，阴干;焦卷柏:取净卷柏段500 g，置锅内用温火加热炒至焦黄色，取出，放凉;卷柏炭:取净卷柏段500 g，置锅内用中火加热炒至焦黑色，取出，放凉。

2.2 色谱条件

色谱柱Shim-pack VP-ODS柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流动相:甲醇-0.1% 磷酸水(65∶35);流速:0.8 mL/min;检测波长:337 nm;柱温:25℃。

2.3 对照品溶液的制备

精密称取穗花杉双黄酮标准品1.0 mg，加少量甲醇溶解，置于25 mL容量瓶，用甲醇定容，摇匀，得对照品溶液。色谱图见图1。

图1 穗花杉双黄酮对照品的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of amentoflavone standard

2.4 供试品溶液的制备

将各供试药材粉碎，过80目筛。精密称取各供试样品30 mg，置于10 mL容量瓶中，加入8 mL甲醇，冷浸过夜，用超声破提取仪提取40 min，放冷后用甲醇定容至10 mL，用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

3 实验结果

3.1 线性关系考察

取对照品溶液，照2.2项下的色谱条件，依次进样 2、4、6、8 和 10 μL，记录相应的色谱面积，以峰面积为纵坐标(Y)，系列对照品溶液浓度为横坐标(X)进行线性回归。回归方程为Y=6×104X-30529，r=0.9999，穗花杉双黄酮进样量在0.08～0.40 μg之间呈良好的线性关系。

3.2 精密度考察

日内精密度:取对照品溶液，在上述色谱条件下，连续进样5次，每次10 μL，求得穗花杉双黄酮峰面积积分值的RSD为0.52%，表明仪器的日内精密度良好。

日间精密度:取对照品溶液，在上述色谱条件下，重复三天，每天连续进样6次，求得穗花杉双黄酮峰面积积分值的RSD为1.38%，表明仪器的日间精密度良好。

3.3 重复性考察

精密称取5份卷柏生品，按2.4项下方法制备成供试溶液，在上述色谱条件下，分别进样，每次10 μL，测得穗花杉双黄酮含量的RSD为0.19%，表明重现性良好。

3.4 稳定性考察

取卷柏生品，按2.4项下方法制备成供试溶液，在上述色谱条件下，分别于 0、2、4、8、16 h 吸取供试品溶液10 μL，进样分析并记录峰面积，穗花杉双黄酮的含量的RSD为0.78%，表明样品溶液在16 h内稳定。

3.5 加样回收率考察

精密称取已知含量的卷柏生品9份，每份15.0 mg，置于10 mL容量瓶。将样品随即分为三份，各加入0.13 mg/mL的标准品溶液0.5、1.0、1.2 mL，按2.4项下方法制成供试品溶液。在上述色谱条件下进样，吸取供试品溶液10 μL进行分析，计算回收率，结果见表1测得穗花杉双黄酮的加样回收率在95.00% ～98.46%之间，RSD为1.23%(n=9)。

表1 加样回收率实验结果Table 1 Recoveries of amentoflavone at three concentration levels

0.120 0.065 0.183 96.91 0.120 0.065 0.184 98.46 0.120 0.130 0.252 96.92 0.120 0.130 0.250 95.38 0.120 0.130 0.251 96.15 0.120 0.160 0.272 95.00 0.120 0.160 0.273 95.62 0.120 0.160 0.277 98.13

3.6 样品含量测定

取卷柏生品，焦卷柏和卷柏炭药材，按2.4项下方法制备成供试溶液，在上述色谱条件下进样，吸取供试品溶液10 μL进行分析，平行做3次。结果见图2和表2。

图2 卷柏生品及不同炮制品的 HPLC色谱图，A卷柏生品;B焦卷柏;C卷柏炭Fig.2 HPLC chromatograms of sample extracts of S．tamariscina(A)，fried S．Tamariscina(B)and S．tamariscina coke(C)

表2 样品测定实验结果(n=3)Table 2 Quantification results of the three samples(n=3)

4 讨论

本文首次采用HPLC法对卷柏不同炮制品中穗花杉双黄酮的含量进行测定。结果表明不同炮制方法后，卷柏中穗花杉双黄酮的含量变化较大。焦卷柏的含量远远高于卷柏生品，而卷柏炭的含量较卷柏生品又有明显降低。清炒过程中温度升高，使药材质地变的疏松，有利于黄酮的提取，致使穗花杉双黄酮含量增加;而炒炭温度过高使其含量降低的原因可能是温度过高黄酮被破坏。应用时要根据不同的需要，采用不同的炮制方法。

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2 Chinese Pharmacopoeia Commission(国家药典委员会).Pharmacopoeia of the People’s Republic of China(中华人民共和国药典).Beijing:Chemical Industry Press，2010.Vol I，157.686.

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