右美托咪啶通过抑制p38和JNK活化减少异氟醚诱导的新生大鼠海马神经元凋亡*

王 飞， 李玉娟△， 曾敏婷， 韩 雪， 戴 婕

(中山大学孙逸仙纪念医院1麻醉科，2药物临床试验机构，广东 广州 510120)

右美托咪啶通过抑制p38和JNK活化减少异氟醚诱导的新生大鼠海马神经元凋亡*

王 飞1， 李玉娟1△， 曾敏婷1， 韩 雪1， 戴 婕2

(中山大学孙逸仙纪念医院1麻醉科，2药物临床试验机构，广东 广州 510120)

目的探讨右美托咪啶(dexmedetomidine, Dex)对异氟醚(isoflurane, Iso)诱导的新生大鼠海马神经元凋亡的影响及其与p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38)和c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)蛋白活化的关系。方法48只出生后7 d的SD大鼠随机分为对照组(Con组)、Dex组、Iso组和Iso+Dex组。前2组吸入空气，后2组吸入0.75% Iso 6 h。Dex组和Iso+Dex组在麻醉前20 min和麻醉开始后2 h、4 h经腹腔注射25 μg·kg-1Dex；Con组和Iso组则在相同的时点注射150 μL生理盐水。麻醉结束后使用TUNEL法检测海马神经元凋亡； Western blotting检测海马组织激活型caspase-3、p38、磷酸化p38(p-p38)、JNK和磷酸化JNK(p-JNK)蛋白表达的变化。结果(1) Iso组海马CA1区TUNEL阳性细胞数较Con组增加447.57%(P<0.01)，Dex抑制Iso诱导的TUNEL阳性细胞增加达75.18%(P<0.01)。(2) Iso组海马组织激活型caspase-3的表达比Con组增加126.29% (P<0.01)；Dex显著抑制了Iso诱导的caspase-3活化(P<0.01)。(3) Iso组海马p-p38/p38和p-JNK/JNK比值均较Con组明显增加(P<0.01)；Dex显著抑制了Iso诱导的p-p38 和p-JNK表达增加(P<0.01)。结论Dex能通过减少海马神经元凋亡来减轻Iso对新生大鼠的脑毒性。抑制p38和JNK的磷酸化可能是Dex发挥保护作用的机制之一。

异氟醚； 右美托咪啶； 海马； c-Jun 氨基末端激酶； p38 丝裂原活化蛋白激酶

全身麻醉是儿科麻醉最常用的麻醉方法，而异氟醚(isoflurane, Iso)作为临床上常用的吸入全身麻醉药，在儿科手术病人中应用非常广泛。但近年来，多篇文章报道使用异氟醚可诱导发育期动物脑神经毒性作用并降低成年后的学习记忆功能[1-6]。由于吸入麻醉药在产科及儿科手术中的使用难以避免，因此，寻找安全有效的减少异氟醚神经毒性的药物具有非常重要的意义。

右美托咪啶(dexmedetomidine, Dex)是临床上常用的高选择性α2-肾上腺素能受体激动剂，具有抑制交感神经、镇静、催眠、镇痛、减少麻醉用药、减少术后谵妄等作用[7]，并对多种神经损伤模型具有保护作用[8]。Sanders等[9-10]发现Dex能剂量依赖性降低异氟醚诱导的出生后7 d大鼠海马神经元凋亡和成年后认知功能障碍，但保护机制尚未明确。我们前期的工作发现，出生后7 d的SD大鼠吸入1.1%异氟醚4 h，可导致皮质磷酸化c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)、磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38)以及激活型caspase-3表达的增加，说明异氟醚导致的凋亡可能与JNK和p38的激活相关[4]。Dex是否能通过抑制JNK和p38激活来减轻异氟醚诱导的细胞凋亡？本研究拟采用出生后7 d SD大鼠吸入0.75%异氟醚6 h的实验模型，同时复合Dex处理，探讨异氟醚诱导海马神经元凋亡和Dex保护作用的机制，为临床麻醉药物以及麻醉方案的选择提供指导。

材 料 和 方 法

1材料

1.1仪器与试剂 麻醉呼吸机和气体监护仪 (Datex-Ohmeda)，Dex(江苏恒瑞医药股份有限公司)，异氟醚(Abbott)，激活型caspase-3单克隆抗体和磷酸化JNK多克隆抗体、磷酸化p38单克隆抗体(Cell Signaling Technology)，JNK单克隆抗体、p38 MAPK单克隆抗体、β-actin单克隆抗体、羊抗兔Ⅱ抗、羊抗小鼠Ⅱ抗和苏木素染色液(上海碧云天生物技术公司)，TUNEL试剂盒(Roche)。

1.2动物及分组 48只SPF级出生后7 d SD大鼠，雌雄不限，12～16 g，由中山大学实验动物中心提供，许可证号为SCXK(粤)2009-011。大鼠随机分为4组：对照组(Con组)、Dex组、Iso组和Iso+Dex组。前2组吸入空气，后2组吸入0.75%异氟醚6 h。Dex组和Iso+Dex组在麻醉前20 min和麻醉开始后2 h、4 h经腹腔注射25 μg·kg-1Dex；Con组和Iso组则在相同的时点注射150 μL生理盐水。麻醉结束后(6 h)立刻取新鲜的海马组织，Western blotting检测海马激活型caspase-3、磷酸化p38、总p38、磷酸化JNK和总JNK蛋白表达变化；另一部分幼鼠灌注取脑，制备石蜡切片，TUNEL法检测海马神经细胞凋亡。

2方法

2.1异氟醚吸入麻醉模型的建立 参照我们以前的方法[4-6]，将需要吸入异氟醚组别的大鼠置于自制透明塑料麻醉箱内，该麻醉箱连接于麻醉呼吸机螺纹管回路中，麻醉呼吸机工作状态为手控模式，调节排气阀接近最小压力，以压缩空气作为载气，通过异氟醚挥发罐后进入麻醉箱，出口处接气体监护仪监测麻醉气体浓度、氧浓度和二氧化碳浓度。调整挥发罐刻度和空气流量，维持异氟醚浓度0.75%。其余动物置入另一个麻醉箱中吸入空气，吸入时间均为6 h。麻醉过程中大鼠保持自主呼吸，持续观察小鼠的呼吸频率和肤色，并将两麻醉箱置于水浴箱中，温度维持36～37 ℃。在麻醉处理过程中，幼鼠呼吸均匀，肤色红润，无明显呼吸抑制。

2.2组织准备 参照我们以前的方法[4-6]，每组在麻醉结束即刻取6只幼鼠，断头取脑，冰上分离脑皮质，液氮速冻后转移至-80 ℃保存，组织用来做Western blotting分析。在麻醉结束后2 h每组各取6只幼鼠，经心脏灌注4%多聚甲醛0.1 mol/L PB液15 min后取脑。脑组织在同样的灌注液中4 ℃后固定48 h后梯度乙醇脱水，石蜡包埋，经冠状平面切取5 μm连续石蜡切片，参照幼鼠脑解剖图谱，每只幼鼠选择3个相同的海马平面的切片(每个切片间隔200 μm)进行TUNEL染色。

2.3TUNEL 检测海马神经元凋亡 根据TUNEL试剂盒说明书，石蜡组织切片常规脱蜡至水；滴加20 mg·L-1蛋白酶K溶液室温反应15 min；滴加TUNEL反应混合液50 μL(TdT 5 μL,荧光素连接的dUTP混合缓冲液 45 μL)后37 ℃湿盒中避光孵育60 min；加含辣根过氧化物酶的抗荧光素抗体37 ℃湿盒中避光孵育 30 min，DAB 显色5～10 min，苏木素复染，脱水，透明，中性树胶封片。参照我们以前的方法[4-6]，使用IP Lab 7.0和Olympus IX70 倒置显微镜获得大脑海马各区×200图像，用Image-Pro Plus软件进行图像分析，计算单位面积TUNEL阳性细胞数。

2.4Western blotting检测蛋白表达 参照我们以前的方法[4-6]，麻醉结束后立即断头处死幼鼠，冰上快速分离海马，加入适量裂解液匀浆后提取蛋白，BCA蛋白定量法测定蛋白浓度并调平各组蛋白浓度。各样本等量蛋白进行SDS-PAGE电泳、转膜、封闭，1∶2 000激活型caspase-3单克隆抗体、1∶1 000磷酸化p38单克隆抗体、1∶2 000磷酸化JNK多克隆抗体、1∶1 000 p38单克隆抗体以及1∶1 000 JNK单克隆抗体4 ℃孵育过夜，1∶1 000 Ⅱ抗室温孵育2 h，使用ECL发光液进行胶片显影。胶片扫描后用Image J软件测量蛋白条带的灰度值，以激活型caspase-3/β-actin、p-p38/p38和p-JNK/JNK比值行半定量分析，其中JNK两条带的分子量分别为54和46 kD，分别以p-p54/p54和p-p46/p46比值进行统计。

3统计学处理

用SPSS 13.0统计软件分析。数据用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，组间两两比较采用最小显著性差异法(LSD法)。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1新生鼠海马CA1区TUNEL阳性细胞的变化

如图1所示，TUNEL法检测凋亡细胞发现Iso组海马CA1区TUNEL阳性细胞数为(94.70±11.82)个/mm2，较Con组[(17.30±4.98)个/mm2] 增加447.57%(P<0.01)；Iso+Dex组TUNEL阳性细胞数为(36.51±11.71)个/mm2，Dex抑制异氟醚诱导的TUNEL阳性细胞增加达75.18%(P<0.01)，但仍与Con组有显著差异(P<0.05)，提示Dex可以显著抑制异氟醚诱导的幼鼠海马神经元凋亡；而Dex组与Con组比较差异无统计学意义，提示Dex不会诱导海马神经元凋亡。

Figure 1. Apoptosis in hippocampal CA1 area of neonatal rats at the end of isoflurane (Iso) or air exposure with or without dexmedetomidine (Dex) treatment was detected by TUNEL staining.A: hippocampal structure (×40); B: control group (×200); C: Dex group (×200); D: Iso group (×200); E: Iso+Dex group (×200). Arrows indicate TUNEL positive cells. Scale bar: 50 μm.Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vsB;##P<0.01vsD.

图1TUNEL法检测新生大鼠海马CA1区神经元凋亡

2新生鼠海马激活型caspase-3表达的变化

Western blotting检测发现Iso组激活型caspase-3比Con组增加126.29% (P<0.01)； Dex完全抑制了异氟醚诱导的caspase-3表达增加，Iso+Dex组与Iso组比较差异有统计学意义(P<0.01)，与Con组比较差异无统计学意义，而Dex单独使用不会显著增加caspase-3的表达，见图2。

Figure 2. Expression of cleaved caspase-3 protein in the hippocampus of neonatal rats at the end of isoflurane (Iso) or air exposure with or without dexmedetomidine (Dex) treatment.Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol (Con) group;##P<0.01vsIso group.

图2Westernblotting检测右美托咪啶对异氟醚诱导的激活型caspase-3表达的影响

3新生鼠海马磷酸化p38表达的变化

Western blotting检测发现Iso组p-p38/p38比值比Con组增加227.83% (P<0.01)，Iso+Dex组p-p38/p38比值较Iso组降低了86.48%(P<0.01)，Iso+Dex组和Con组差异无统计学意义，提示Dex完全抑制了异氟醚诱导的磷酸化p38表达增加；而Dex组与Con组比较差异无统计学意义，提示Dex单独使用对p-p38的表达影响不大，见图3。

4新生鼠海马磷酸化JNK表达的变化

Western blotting检测发现Iso组p-p54/p54比值比Con组增加314.25% (P<0.01)，Iso+Dex组p-p54/p54比值较Iso组减少89.75% (P<0.01)；Iso组p-p46/p46比值比Con组增加71.59% (P<0.01)，Iso+Dex组p-p46/p46比值较Iso组减少72.26% (P<0.05)；Iso+Dex组与Con组相比，p-p54/p54和p-p46/p46比值差异均无统计学意义，提示Dex完全抑制了异氟醚诱导的磷酸化JNK表达增加；而Dex组与Con组比较差异无统计学意义，提示Dex单独使用对p-JNK的表达影响不大，见图4。

讨 论

异氟醚是NMDA受体拮抗剂与GABA受体激动剂，目前的研究发现其对发育动物的大脑具有诱导神经元凋亡的作用，而产生的神经毒性作用最为敏感的时期是脑突触形成期(啮齿类约相当于出生后0～14 d)[11-12]。在啮齿动物中使用异氟醚或联合使用N2O和咪唑安定，在出生后1～3 d可观察到多个脑区神经元出现凋亡，这种神经元凋亡现象在出生后7 d使用麻醉药的幼鼠大脑中达到高峰，而出生后10～14 d使用麻醉药的幼鼠凋亡程度明显下降[2]。因此，本实验选取了出生后7 d的SD大鼠来作为研究异氟醚发育神经毒性的实验动物，同时用Dex来干预和试图阐明其保护机制。

Figure 3. Expression of p-p38,p38 and β-actin proteins in the hippocampus of neonatal rats at the end of isoflurane (Iso) or air exposure with or without dexmedetomidine (Dex) treatment.Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol (Con) group;##P<0.01vsIso group.

图3Westernblotting检测右美托咪啶对异氟醚诱导的磷酸化p38表达的影响

Figure 4. Expression of p-JNK，JNK and β-actin proteins in the hippocampus of neonatal rats at the end of isoflurane (Iso) or air exposure with or without dexmedetomidine (Dex) treatment.Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol (Con) group;#P<0.05,##P<0.01vsIso group.

图4Westernblotting检测右美托咪啶对异氟醚诱导的磷酸化JNK表达的影响

我们[4]前期研究发现，1.1%异氟醚诱导新生鼠脑皮质神经元凋亡增加。本研究选用更低浓度的0.75%异氟醚麻醉幼鼠6 h，在海马组织中同样也发现凋亡细胞增加以及凋亡蛋白caspase-3的表达增加。而且，异氟醚诱导的海马神经元凋亡可以被Dex 重复给药所抑制。由于Dex的半衰期为2 h，本研究选择Dex 每隔2 h间断给药以维持Dex的作用效果。结果发现Dex (25 μg·kg-1)，每隔2 h间断给药能显著减少TUNEL阳性细胞数的增加，使激活型caspase-3的蛋白表达水平显著降低，这与Sanders等[9]结论相一致。

MAPK级联信号通路是介导信号从细胞表面向核内传递的重要信号系统，参与细胞生长、增殖、分化、凋亡及细胞间的功能同步等多种生理过程。MAPK信号通路主要包括细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)1/2、JNK和p38信号通路。Dex保护作用的机制与MAPK信号通路之间的关系目前研究较少。Sanders等[10]发现Dex能增加ERK的表达，认为Dex降低异氟醚诱导的出生后7 d大鼠海马神经元凋亡和成年后认知功能障碍的保护机制可能与ERK信号通路有关。我们前期研究发现1.1%异氟醚可以增加新生鼠皮质磷酸化JNK和p38的表达，本研究也证实0.75%的异氟醚也可以增加新生鼠海马磷酸化JNK和p38的表达，说明异氟醚导致的凋亡可能与JNK和p38的激活相关。Dex保护作用与JNK和p38的表达有何关系呢？本研究发现Dex能完全抑制异氟醚诱导的p38和JNK磷酸化，提示抑制p38和JNK的活性可能是Dex抑制异氟醚诱导的海马神经元凋亡的机制之一。

JNK和p38同属应激激活蛋白，在很多神经损伤与细胞凋亡模型中能被激活[13-15]。JNK活化后可以进入线粒体，切割Bid蛋白，促进其向线粒体转移，激活Bax，促细胞色素C的释放； JNK还可以磷酸化Bim 和Bmf，进而激活Bax和/或 Bak 并促进凋亡，而磷酸化的Bim还可以抑制Bcl-2和Bcl-xL； JNK可以磷酸化Bad丝氨酸128位点来加强Bad的促凋亡作用；激活的JNK还可以磷酸化Bcl-2和Bcl-xl，抑制其抗凋亡的活性[16]。而p38活化后激活HIF-1和上调Noxa蛋白，下调抗凋亡蛋白Mcl-1，促进Bax从胞质向线粒体转移，引起细胞色素C的释放[17-18]；促进Bid的切割[19]，进而激活线粒体途径导致凋亡。由此可见，JNK和p38可以通过影响线粒体功能来促进凋亡。已有文献报道异氟醚可能通过下调神经元Bcl-2/Bax[20]或Bcl-xL/Bad[5]比值的线粒途径促细胞凋亡，导致细胞核染色质固缩、断裂，caspase-3和caspase-9的增加。而Dex可以通过调控Bax和Bcl-2的平衡而起到神经保护作用[21]。故我们猜测线粒体功能状态的变化可能是异氟醚促凋亡、Dex抑凋亡的中心环节，而JNK和p38的激活起到桥梁的作用。异氟醚可能通过激活JNK和p38来激活促凋亡蛋白的转录和线粒体凋亡途径，而Dex则可以通过抑制JNK和p38的活性来抑制促凋亡蛋白的转录和线粒体凋亡途径。以上假设将在以后的研究中逐步完善。

本研究有一定的局限性，如没有设置多个时点来观察JNK和p38的变化，没有用JNK和p38特异性的抑制剂来直接证明其在异氟醚促凋亡和Dex抑凋亡中的作用，没有通过相关行为学实验来验证异氟醚和Dex对大鼠成年后学习记忆和认知的影响，这些实验将在以后的研究中逐步完善。

综上所述，本研究通过给出生后7 d新生大鼠吸入0.75%异氟醚6 h，并联合使用Dex，发现Dex可能通过抑制p38和JNK的激活来减少异氟醚致新生大鼠海马神经元的凋亡，为临床麻醉药物以及麻醉方案的选择提供指导。

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Dexmedetomidinereducedisoflurane-inducedneuroapoptosisbyinhibitingactivationofp38andJNKproteinsinhippocampusofneonatalrats

WANG Fei1, LI Yu-juan1, ZENG Min-ting1, HAN Xue1, DAI Jie2

(1DepartmentofAnesthesiology,2DepartmentofDrugClinicalTrialInstitute,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China.E-mail:yujuan_04@hotmail.com)

AIM: To investigate the effect of dexmedetomidine (Dex) on neuronal apoptosis induced by isoflurane (Iso) and its relationship with the expression of p38 mitogen-activated protein kinase (p38) and c-Jun N-terminal kinase (JNK) proteins in the hippocampus of neonatal rats.METHODSForty-eight neonatal SD rats at postnatal day 7 were randomly divided into control group (Con), Dex group, Iso group and Iso combined with Dex (Iso+Dex) group. Rats in Iso and Iso+Dex groups were exposed to 0.75% Iso for 6 h, while rats in Con and Dex groups were exposed to air for 6 h. Rats were intraperitoneally injected with 25 μg·kg-1Dex (Dex and Iso+Dex groups) or 150 μL saline (Con and Iso groups) 20 min before exposure and 2 and 4 h after exposure. After the termination of anesthesia, the neuronal apoptosis in hippocampal CA1 region was detected by TUNEL staining, and the protein expression of cleaved caspase-3, phospho-p38 (p-p38), p38, phospho-JNK (p-JNK) and JNK in hippocampal tissues was detected by Western blotting.RESULTSThe number of TUNEL positive cells in hippocampal CA1 region of the rats in Iso group was increased by 447.57% (P<0.01) compared with Con group, while Dex significantly inhibited the increased TUNEL positive cells in Iso group by 75.18% (P<0.01). The expression of cleaved caspase-3 protein in Iso group was increased by 126.29% (P<0.01) compared with Con group, while Dex reversed the increased cleaved caspase-3 protein expression (P<0.01). Iso significantly increased the phosphorylation of p38 and JNK proteins (P<0.01), while Dex reversed the increased p-p38 and p-JNK proteins (P<0.01).CONCLUSIONDex attenuates Iso-induced neuroapoptosis in the hippocampus of neonatal rats through inhibiting the phosphorylation of p38 and JNK proteins.

Isoflurane; Dexmedetomidine; Hippocampus; c-Jun N-terminal kinase; p38 mitogen-activated protein kinases

R965

A

1000- 4718(2013)09- 1651- 06

2013- 04- 15

2013- 07- 09

国家青年自然科学基金资助项目(No. 30700787/C03030301)；广东省自然科学基金资助项目 (No. S2011010004558)；广东省科技社会发展项目(No. 2012B031800374)

△通讯作者 Tel: 020-81332060； E-mail: yujuan_04@hotmail.com

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.09.020