离子霉素对SW480和SWO-38细胞中E-cadherin裂解的影响*

王 超， 杜 展， 马继伟， 张 勇， 闫雍容， 钟雪云

(暨南大学医学院病理学系，广东 广州 510632)

离子霉素对SW480和SWO-38细胞中E-cadherin裂解的影响*

王 超， 杜 展， 马继伟， 张 勇， 闫雍容， 钟雪云△

(暨南大学医学院病理学系，广东 广州 510632)

目的观察可促进钙离子内流的工具药离子霉素(ionomycin)，对不同肿瘤细胞株SW480及SWO-38其C末端片段2(E-cad/CTF2)的表达裂解的影响。方法应用MTT法确定ionomycin作用于 SW480及SWO-38细胞的最佳浓度；Western blotting检测ionomycin 作用不同时间后E-cadherin全长及其C末端片段2(E-cad/CTF2)的表达水平；共聚焦显微镜动态检测SWO-38细胞胞内Ca2+浓度变化。结果Ionomycin对SW480及SWO-38细胞均有细胞毒性作用，半数抑制浓度均为12 μmol/L，ionomycin可促进 SW480细胞中Ca2+浓度增加，E-cadherin裂解，E-Cad/CTF2片段水平升高，ionomycin没有引起SWO-38细胞中的大量钙内流，对E-cadherin裂解没有明显作用。结论Ionomycin可促进钙离子内流，引起SW480肿瘤细胞E-cadherin裂解，但对SWO-38细胞E-cadherin裂解无明显影响。

离子霉素； 钙黏着蛋白类； 钙内流

上皮型钙黏着蛋白(epithelial cadherin，E-cadherin)作为经典钙黏着蛋白家族中的重要成员，在多种肿瘤组织中表达，并与疾病的进展相关。经凋亡或Ca2+内流刺激，可引起E-cadherin的裂解，生成E-cadherin胞内域片段并释放β-catenin 及α-catenin至可溶性胞质，从而促进E-cadherin为基础的黏附连接的分解，影响细胞间黏附、信号转导等[1]。其中长为33 kD的E-cadherin C末端片段2(E-cadherin C-terminal fragment 2，E-Cad/CTF2)，可作为细胞间黏附和Wnt信号转导通路之间转换的中间桥梁，进一步影响通路下游靶向基因，全面影响肿瘤等疾病的发生、发展[2]。

离子霉素(ionomycin)是研究Ca2+对细胞内各种生物效应调控机制的重要工具药。有研究表明，ionomycin作用于野生型E-cadherin人皮肤基底细胞癌A431细胞，可促进E-Cad/CTF2的生成和增加，易化细胞间黏附连接的分解以及抑制β-catenin与下游靶向分子的结合[1]。但是关于ionomycin能否促进其它肿瘤细胞中E-cadherin的裂解及其机制，目前尚不清楚。本研究采用ionomycin作用于高表达E-cadherin的SW480及SWO-38细胞，分析对比了 ionomycin在不同肿瘤细胞中裂解E-cadherin的能力及原因，以期对ionomycin 促进钙离子内流导致E-cadherin水解而裂解在肿瘤发展中的作用有更深入的了解。

材 料 和 方 法

1材料

人脑胶质瘤细胞SWO-38系由暨南大学医学院病理教研室自行建立[3]。人结肠癌细胞SW480系由南方医科大学病理系实验室赠予。Ionomycin购自Sigma。细胞培养基RPMI-1640和灭活胎牛血清购自Gibco。MTT购自Sigma。细胞裂解液及BCA蛋白定量试剂盒购自碧云天生物技术公司。Western blotting检测所用特异性针对E-cadherin胞内域的鼠抗人E-cadherin(C36)抗体购自BD。兔抗人α-tubulin抗体购自CST。辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠、羊抗兔IgG购自杭州联科公司。增强型化学发光液(enhanced chemiluminescence，ECL)购自Pierce。Fura-3/AM探针购自碧云天生物技术公司。

2方法

2.1细胞培养 SWO-38及SW480细胞均采用含有10%灭活胎牛血清及1×105IU/L双抗的RPMI-1640培养基，在37 ℃、5%CO2培养箱中常规培养。采用含 EDTA的0.25%蛋白胰酶消化传代。培养24 h后，向细胞中加入ionomycin等处理因素。

2.2MTT法筛选ionomycin的最佳作用浓度 选择对数生长期、状态良好的SWO-38及SW480细胞，取1.5×107/L 细胞接种于96 孔板，约24 h后，加入配制好的ionomycin液，浓度分别为3、6、12、24、46 μmol/L，并设置对照组及空白调零孔，每组5个复孔。在培养箱中培养45 min后，每孔加入20 μL MTT溶液，继续培养4 h后，弃上清液，终止培养，每孔加入150 μL DMSO，振荡器上振荡10 min。选取570 nm波长，在酶标仪上测定吸光度(A)，按公式计算细胞抑制率。细胞抑制率(%)=(A对照组-A处理组)/A对照组×100%。IC50定义为细胞抑制率为50%时的作用浓度。

2.3Western blotting法检测E-cadherin全长及E-Cad/CTF2蛋白表达 SWO-38 及SW480细胞，均加入12 μmol/L ionomycin，分别培养0、45、90 min。按BCA蛋白提取试剂盒说明书操作，提取细胞总蛋白并测定其浓度，每个泳道加入20 μg 蛋白进行SDS-PAGE电泳。之后湿转将蛋白转至NC膜，需60 min。5%脱脂牛奶室温封闭60 min后剪下包含目的蛋白的NC膜，加入相应的Ⅰ抗，包括抗E-cadherin(1∶1 000)和α-tubulin(1∶1 000)，4 ℃摇床孵育过夜。TBST洗3次后加入辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗，室温孵育1 h。采用ECL发光系统显色，扫描胶片，BI-2000 图像分析系统测量分析各条带的积分吸光度值。

2.4共聚焦显微镜检测胞内游离钙离子浓度 SWO-38细胞稀释至1×108/L，加入共聚焦皿；培养24 h后，将5 μmol/L Fura-3/AM加入皿中，避光室温孵育30 min。PBS清洗2次后，加入溶有12 μmol/L ionomycin的培养液，于共聚焦显微镜下连续观测48 min。激发光波长为488 nm，发射光波长为530 nm，扫描点数为512 × 512，扫描速度每30 s 1张。采用Zeiss LSM Image Browser软件分析荧光强度，取单个细胞的荧光强度测定值的平均数代表细胞内游离Ca2+浓度。

3统计学处理

SPSS 13.0 统计软件包统计分析数据，数据以均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较采用两样本t检验及单因素方差分析(ANOVA)，以P<0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1Ionomycin最佳作用浓度

不同浓度ionomycin(3、6、12、24和46 μmol/L)分别作用于SWO-38和SW480细胞45 min后，与对照组比较，随着ionomycin作用浓度的升高，各实验组细胞抑制率升高，细胞抑制率差异均有统计学意义，见图1。SW480及SWO-38细胞的 IC50均为12 μmol/L。上述结果表明ionomycin在这2种肿瘤细胞中具有细胞毒性且呈浓度依赖性。

2Ionomycin可促进SW480细胞中E-cadherin裂解

Ionomycin采取IC50的浓度作用于SW480及SWO-38细胞,45及90 min后分别提取蛋白进行Western blotting检测。结果显示，SW480细胞E-cadherin 蛋白全长片段表达水平逐渐下降(P<0.05)，相反的，E-Cad/CTF2表达水平逐渐上升(P<0.05)，见图2；SWO-38细胞E-cadherin蛋白全长片段表达水平没有显著变化(P>0.05)，E-Cad/CTF2则没有出现，见图3。上述结果表明，ionomycin只能促进部分肿瘤细胞E-cadherin的裂解。

Figure 1. The inhibitory rates of the cells after treatment with ionomycin for 45 min. A: SW480 cells; B: SWO-38 cells. Mean±SD.n=5.*P<0.05vs0 μmol/L.

图1MTT法检测ionomycin对细胞的毒性

Figure 2. The levels of full-length E-cadherin and E-Cad/CTF2 in SW480 cells detected by Western blotting. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 min.

图2Westernblotting检测SW480细胞中E-cadherin全长及E-Cad/CTF2的水平

Figure 3. The levels of full-length E-cadherin and E-Cad/CTF2 in SWO-38 cells detected by Western blotting. Mean±SD.n=3.

图3Westernblotting检测SWO-38细胞中E-cadherin全长及E-Cad/CTF2的水平

3共聚焦显微镜监测ionomycin作用后细胞内Ca2+变化

为了进一步探究ionomycin对SWO-38细胞的作用，采用钙离子荧光探针 Fura-3/AM检测细胞内游离Ca2+浓度的变化。共聚焦显微镜下可观察到，SWO-38细胞呈多角形，可探测到的绿色荧光较弱，均匀分布于胞内，有少量可聚集，见图4。经连续观测，12 μmol/L ionomycin作用后，SWO-38细胞胞内的游离Ca2+浓度除了在60和210 s形成2个微弱的高峰(P>0.05)外，整体反而呈逐渐下降的趋势，见图5、表1。上述结果表明ionomycin不能促进SWO-38细胞的钙内流。

讨 论

E-cadherin被形容为可介导细胞黏附的经典黏附蛋白，在机体正常发育中起基本作用，在肿瘤形成和进展中其调控多已紊乱[4-5]。在机体正常发育或伤口愈合、钙离子内流、细胞凋亡的进程中，E-cadherin可通过水解而裂解，将几乎整个胞内域结构释放，从而促进细胞迁移及改变所参与的信号通路的状态[6]。其中，利用ionomycin促进钙离子内流，可引起E-cadherin裂解，E-Cad/CTF2出现并增加[1, 7]，但现有的研究大多局限于上皮细胞的生理性研究或少数上皮性质的癌细胞中，对于E-cadherin在其它肿瘤中因钙内流引起的水解变化及影响鲜有涉及。因此，论证此过程在其它肿瘤细胞中是否可行，变得尤为重要。

Figure 4. Changes of cytosolic Ca2+concentration in Fura-3/AM-loaded SWO-38 cells under confocal microscope. A: fluorescent image; B: phase-contrast image.

图4共聚焦显微镜下Fura-3/AM探针探测SWO-38细胞胞内Ca2+浓度的变化

Figure 5. The fluorescence intensity indicated a slight decrease in the cytosolic Ca2+concentration in Fura-3/AM-loaded SWO-38 cells after exposure to 12 μmol/L ionomycin. It reached the peak at 60 and 210 s (arrows).

图5Ionomycin对SWO-38细胞胞内Ca2+浓度的影响

本研究选择E-cadherin相对表达较高的人结肠癌SW480细胞及人脑胶质瘤SWO-38细胞，作为研究对象。经MTT法检测，ionomycin对2种肿瘤细胞均有细胞毒性作用，且呈浓度依赖性。经筛选，采用IC50作为接下来实验的作用浓度。Ionomycin作为最具代表性的促进钙离子内流药物，被广泛应用：ionomycin可诱导氨基末端激酶和p38的生成[8]；ionomycin对卵子激活和胚胎发育有负面影响[9]；采用ionomycin可增加SH-SY5Y细胞中N-cadherin的分裂片段N-Cad/CTF2的增加[10]。本实验同样证明，ionomycin可通过促进钙离子内流，引起SW480细胞中 E-cadherin的裂解，E-Cad/CTF2片段出现，并且E-cadherin全长片段表达逐渐降低，E-Cad/CTF2随着ionomycin作用时间的延长而增多。然而，SWO-38细胞的结果与预期的并不相符，同样条件的ionomycin作用于细胞株，并没有减少E-cadherin全长片段的表达，也没有通过全长片段的分解生成E-Cad/CTF2或其它任何长度的E-cadherin片段。为了进一步研究其中的原因，我们采用 Fura-3/AM钙离子荧光探针动态监测了ionomycin作用于SWO-38细胞，其胞内游离钙离子的变化。实验结果表明，除了在60和210 s时点胞内游离Ca2+浓度轻微升高以外，整体的钙离子浓度随着ionomycin作用时间的延长逐渐下降，换言之，ionomycin并没有大量促进SWO-38细胞中钙离子的内流，这也同时印证了E-Cad/CTF2片段没有出现的原因。有针对ionomycin作用机制进行研究的文献表明，ionomycin促进钙离子内流可因其作用浓度不同而分为2种方式，即 Ca2+/H+交换和钙池调控钙离子通道，涉及到去极化、胞外钙离子浓度所形成的推动力，是一项复杂的过程[11]。我们推测SWO-38细胞可能由于欠缺这些条件或本身细胞结构已发生变化，而不具备ionomycin能够起效的环境。

表1不同时点ionomycin对SWO-38细胞内游离钙离子浓度的影响

Table 1. Effects of ionomycin on cytosolic Ca2+concentration in SWO-38 cells at different time points(Mean±SD.n=10)

Time(s)Fluorescenceintensity017.33±7.126017.48±7.2621017.42±7.3151016.07±6.5281015.23±5.95111013.52±5.05141014.79±5.87171013.65±5.87201013.33±5.65231013.11±5.25261012.52±4.49

许多研究表明，E-Cad/CTF2的产生，可将E-cadherin为基础的细胞间黏附与Wnt信号通路联系起来。E-Cad/CTF2的氨基末端序列证实，E-cadherin 的裂解发生在跨膜和胞质域的接触面，符合PS1/γ-酶介导的裂解[1]。E-Cad/CTF2的生成，导致与E-cadherin结合的β-catenin自细胞骨架释放，易位入核；E-Cad/CTF2与β-catenin保持结合状态，从而抑制β-catenin降解并有效地抑制其反式激活的能力[12]。β-catenin无法与核中淋巴细胞增强结合因子结合，使得下游的重要靶向基因cyclin D1等无法被激活，从而抑制细胞周期、细胞迁移等[13]。我们接下来的研究重点将集中于ionomycin作用引起SW480细胞中 E-Cad/CTF2出现后，会引发怎样一系列改变，对肿瘤的发生、发展会有哪些影响。

本实验结果显示，ionomycin对肿瘤细胞普遍具有细胞毒性；可通过钙内流，引起一部分肿瘤细胞株中E-cadherin的裂解，生成代表胞内域片段的E-Cad/CTF2；但并不是所有表达E-cadherin的肿瘤细胞株具备ionomycin作用的环境，能在其使用后进行E-cadherin的水解而分裂成不同片段。综上所述，本实验为ionomycin 促进钙离子内流在肿瘤细胞株中的作用有了全面的了解，对E-cadherin的水解作用机制进行了深入探索，为不同肿瘤发生、发展的分子进程提出了新的视角。

[1] Marambaud P, Shioi J, Serban G, et al. A presenilin-1/γ-secretase cleavage releases the E-cadherin intracellular domain and regulates disassembly of adherens junctions[J]. EMBO J,2002,21(8):1948-1956.

[2] McCusker CD, Alfandari D. Life after proteolysis: exploring the signaling capabilities of classical cadherin cleavage fragments[J]. Commun Integr Biol,2009,2(2):155-157.

[3] 司徒锐，王惠华，王锦环，等. 人脑恶性胶质瘤体外细胞系SWO-38的建立和生物学特性[J]. 癌症,1987,6(4):235-238.

[4] Takeichi M. Cadherins in cancer: implications for invasion and metastasis[J]. Curr Opin Cell Biol,1993,5(5):806-811.

[5] 俞 岚，武世伍，宋文庆，等.卵巢上皮癌中血管生成拟态和E-钙黏蛋白表达及其临床意义[J].中国病理生理杂志，2011，27(11)：2120-2125.

[6] Heuberger J, Birchmeier W. Interplay of cadherin-mediated cell adhesion and canonical Wnt signaling[J]. Cold Spring Harb Perspect Biol,2010,2(2):a002915.

[7] Maretzky T, Reiss K, Ludwig A, et al. ADAM10 mediates E-cadherin shedding and regulates epithelial cell-cell adhesion, migration, and β-catenin translocation[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,2005,102(26):9182-9187.

[8] Parra E. Activation of MAP kinase family members triggered by TPA or ionomycin occurs via the protein phosphatase 4 pathway in Jurkat leukemia T cells[J]. Mol Med Report,2012,5(3):773-778.

[9] Vasilev F, Chun JT, Gragnaniello G, et al. Effects of ionomycin on egg activation and early development in starfish[J]. PLoS One,2012,7(6):e39231.

[10] Uemura K, Kihara T, Kuzuya A, et al. Activity-dependent regulation of β-catenin via ε-cleavage of N-cadherin[J]. Biochem Biophys Res Commun,2006,345(3):951-958.

[11] Yoshida H, Hirono C, Shimamoto C, et al. Membrane potential modulation of ionomycin-stimulated Ca2+entry via Ca2+/H+exchange and SOC in rat submandibular acinar cells[J]. J Physiol Sci,2010,60(5):363-371.

[12] Parisiadou L, Fassa A, Fotinopoulou A, et al. Presenilin 1 and cadherins: stabilization of cell-cell adhesion and proteolysis-dependent regulation of transcription[J]. Neurodegener Dis,2004,1(4-5):184-191.

[13] Gavert N, Ben-Ze’ev A. β-Catenin signaling in biological control and cancer[J]. J Cell Biochem,2007,102(4):820-828.

EffectsofionomycinoncleavageofE-cadherininSW480cellsandSWO-38cells

WANG Chao, DU Zhan, MA Ji-wei, ZHANG Yong, YAN Yong-rong, ZHONG Xue-yun

(DepartmentofPathology,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:tzxy@jnu.edu.cn)

AIM: To observe the effect of ionomycin on the cleavage of E-cadherin in SW480 cells and SWO-38 cells.METHODSMTT assay was used to determine the optimal concentration of ionomycin for SW480 cells and SWO-38 cells. The levels of full-length E-cadherin and E-cadherin C-terminal fragment 2 (E-Cad/CTF2) after ionomycin treatment at different time points were detected by Western blotting. The variation of cytosolic free calcium concentration in SWO-38 cells after treatment with ionomycin was monitored under confocal microscope.RESULTSIonomycin had cytotoxic effect on SW480 cells and SWO-38 cells. The IC50for both cell lines was 12 μmol/L. Treatment with ionomycin resulted in increased cytosolic free calcium concentration in SW480 cells, leading to cleavage of E-cadherin and increasing the level of E-Cad/CTF2. However, ionomycin did not induce significant calcium influx in SWO-38 cells. Consequently, the cleavage of E-cadherin was not detectable.CONCLUSIONIonomycin triggers calcium influx and induces cleavage of E-cadherin in SW480 cells.

Ionomycin; Cadherins; Calcium influx

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.06.027

1000- 4718(2013)06- 1119- 05

2013- 01- 21

2013- 04- 28

国家自然科学基金资助项目 (No. 81072059)；国家自然科学基金青年基金资助项目(No. 81101652)；广东省高等学校科技创新重点项目(No. CXZD1110)；广东省自然科学基金资助项目(No. 10151063201000059)

△通讯作者 Tel： 020-85228363； E-mail： tzxy@jnu.edu.cn