太子参总皂苷含量测定方法研究

张 敏，王慧娟，林 冰，赵 致，周 英，3*

(1.贵州大学 生命科学学院，贵州 贵阳550025;2.贵州大学贵州省中药(民族药)创制工程中心，贵州贵阳550025;3.贵州大学贵州省中药材繁育与种植重点(工程)实验室，贵州贵阳550025)

太子参为石竹科Caryophyllaceae植物孩儿参Pseudostellaria heterophylla(Miq.)Pax ex Pax et Hoffm.的干燥块根，始见于清代的《本草从新》。黄文哲等在研究太子参6个不同极性提取物对小鼠免疫功能的影响时，发现太子参中的苷类和多糖等大极性成分是太子参提高机体免疫功能的有效物质［1］;熊和健等通过研究太子参提取物体外抗氧化活性，发现太子参皂苷粗提物具有明显抗氧化活性［2］。

虽然太子参皂苷的药理作用已经逐渐明确，但关于太子参皂苷的含量测定研究还较为鲜见。由于缺少对照品，目前使用最多的方法是太子参药材粉末经水提醇沉后，滤液用正丁醇萃取后制备成供试液，以人参皂苷为标准品，应用香草醛－高氯酸显色后于可见光区测定［3］。但该方法工作量较大，工作效率较低，易造成总皂苷的损失，导致测定结果偏低。因此，本研究参照人参、重楼等贵重药材的总皂苷测定方法，旨在缺少太子参皂苷自身对照品的情况下，建立太子参总皂苷含量的快速测定法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试药 太子参药材粉末，购于贵州省药材公司。

1.1.2 仪器与试剂FA2004型分析天平(上海良平仪器仪表有限公司);恒温水域锅(金坛市大地自动化仪器厂);SHZ－95B型循环水压式多用真空泵(上海予正仪器设备有限公司);SG8200HPT超声波清洗器(上海冠特超声仪器有限公司);SZ－93A自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂);GZX－9146MBE数显鼓风干燥箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂);722S可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)。人参皂苷Rb1(中国食品药品检定研究院);无水乙醇(AR，重庆川东化工集团有限公司);浓硫酸(AR，重庆川东化工集团有限公司);香草醛(AR，天津市科密欧化学试剂开发中心);高氯酸(AR，成都金山化学试剂有限公司);冰乙酸(AR，天津市永大化学试剂有限公司);甲醇(AR，重庆川东化工集团有限公司);正丁醇(AR，成都金山化学试剂有限公司);双蒸水(自制)。

1.2 方法

1.2.1 供试液制备单因素考察 根据文献中人参皂苷的超声波半微量提取快速测定法［4］，称取过药典5号筛的太子参药材粉末0.1 g于具塞锥形瓶中，加入25 mL溶剂，超声40 min(功率500 W，频率50 Hz)，取出后抽滤，取5 mL续滤液于蒸发皿中，水浴蒸干后，甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，作为供试液。取供试液2 mL置于10 mL具塞试管中，于沸水浴下挥去溶剂，加入5%的香草醛－冰醋酸溶液(用前临时配制)0.2 mL和0.8 mL高氯酸混匀，密塞，置60℃水浴中加热20 min后取出，用冷水冷却后，加入5 mL冰醋酸，摇匀。另取相同体积甲醇为空白对照，于560 nm波长处测定吸光度，并计算总皂苷占生药的含量(%)。

(1)提取溶剂考察。分别以甲醇、无水乙醇、水饱和的正丁醇为提取溶剂，制备太子参供试液，测定总皂苷含量分别为2.72%、0.66%、2.14%。使用不同提取溶剂，供试液中引入的杂质不同。根据文献报道，太子参中所含的皂苷总量不超过1.0%［3］。因此，选用无水乙醇为溶剂时所制得的皂苷供试液中杂质最少。本研究选用无水乙醇为提取溶剂。

(2)料液比的筛选。称取过药典5号筛的太子参药材粉末0.1 g于具塞锥形瓶中，分别加入10、15、20、25 mL无水乙醇溶液，超声提取后测定总皂苷含量分别为0.62%、0.73%、0.71%、0.66%。皂苷含量与加入的溶剂量为非正相关关系，溶剂量增大到一定值，皂苷含量反而减少。当称取0.1 g药材加入15 mL无水乙醇时，所制得的供试液中总皂苷含量最高。因此，本研究选择加入15 mL无水乙醇制备供试液。

(3)药材粒度的筛选。分别称取过药典3、5、6、7、8号筛的样品药材0.1 g，再分别加入15 mL无水乙醇溶液，超声提取后测定总皂苷含量分别为0.48%、0.73%、0.74%、0.75%、0.74%。当药材粒度为过药典7号筛时所测得的皂苷含量最高。而过药典8号筛与过药典6号筛所测定的结果一致，可能是由于过8号筛的药材粒度过小，部分药渣堵塞滤纸，导致结果偏低。因此，本研究选用过药典7号筛的药粉进行测定。

(4)提取时间的筛选。分别称取样品药材粉末0.1 g(过药典7号筛)加入15 mL无水乙醇后，分别超声提取20、30、40、60、90、120、150 min，测定总皂苷含量分别为0.45%、0.65%、0.75%、0.76%、0.78%、0.79%、0.73%。试验可知，提取时间为120 min时制备的供试液皂苷含量测定值最高。在120 min之前测定的皂苷含量随提取时间的增加而升高。当提取时间为150 min时，测定结果明显降低，可能是由于超声150 min后，提取溶剂升温，导致部分待测成分结构改变，使测定结果降低。由于提取90 min与提取120 min皂苷测定值基本相等，考虑到工作效率，本研究选用提取90 min进行测定。

1.2.2 供试液制备 称取太子参药材粉末0.1 g(过药典7号筛)，加入无水乙醇15 mL，超声提取90 min，过滤后取续滤液5 mL于蒸发皿中，水浴蒸干后，用甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，作为供试液备用。

1.2.3 供试液显色系统筛选 鉴于太子参总皂苷测定中缺少从太子参中分离得到的对照品，因此，选用化学结构相近的人参皂苷Rb1对照考察了供试液测定时的显色系统。取太子参供试液2 mL于具塞试管中，水浴挥干溶剂后，分别按下列显色系统于560 nm处进行显色反应，测定吸光度;同时称取10.76 mg人参皂苷Rb1用甲醇溶解并定容于25 mL容量瓶中，混合均匀后，取0.2 mL于具塞试管中，水浴挥干溶剂，分别按下列显色系统进行显色反应:

(1)加入高氯酸5 mL，置25℃水浴中保温20 min，取出冷却至室温后测定［5］。

(2)加入5%香草醛－冰醋酸溶液0.2 mL，摇匀后，加入60%硫酸溶液5 mL，混合均匀后于60℃水浴中保温20 min，取出冷水冷却后测定［6］。

(3)加入8%香草醛－乙醇溶液0.2 mL，摇匀后，加入60%硫酸溶液5 mL，混合均匀后于60℃水浴中保温20 min，取出冷水冷却后测定［6］。

(4)加入5%香草醛－冰醋酸溶液0.2 mL，摇匀后，加入高氯酸0.8 mL，混合均匀后于60℃水浴中保温20 min，取出冷水冷却后加入5 mL冰醋酸溶液，摇匀后测定吸光度［7］。

(5)称取香草醛0.1 g于10 mL的容量瓶中，加入2 mL冰醋酸和8 mL高氯酸，配置成5%香草醛－冰醋酸和高氯酸的1∶4的混合液，取上述混合液1 mL，于样品具塞试管中摇匀后，置于60℃水浴中保温20 min，取出冷水冷却后加入5 mL冰醋酸溶液，摇匀后测定吸光度［8］。

每种显色系统分别用太子参皂苷供试液和人参皂苷Rb1标准液(0.45 mg/mL，每次0.2 mL参与反应)同步测定初始吸光度(A0min)和60 min时的吸光度(A60min)，并计算吸光度的改变率。综合考察显色系统的灵敏度和稳定性，筛选显色系统。吸光度的改变率计算公式如下:

1.2.5 供试液制备正交设计优化 由单因素考察试验可知，当选定提取溶剂后，药材颗粒度、料液比、提取时间3个因素对总皂苷含量影响较大，因此，以这3个因素设计了L9(34)3因素3水平的正交试验(表1)。

表1 正交试验方案Tab.1 The factors and levels of orthogonal test

1.2.4 方法学考察

(1)线性关系考察。对照品溶液制备:称取人参皂苷Rb1对照品4.5 mg，置25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，摇匀，作为标准溶液。

标准曲线制备:吸取对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mL，分别置于10 mL具塞试管中，于水浴下挥去溶剂，加入5%香草醛－冰醋酸溶液0.2 mL，摇匀后，加入60%硫酸溶液5 mL，混合均匀后于60℃水浴中保温20 min，取出冷水冷却后测定吸光度。以甲醇为空白对照，于560 nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线。以人参皂苷Rb1对照品溶液浓度(μg/mL)为横坐标，测得的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

(2)精密度试验。按1.2项下太子参皂苷供试液制备的方法，制备皂苷供试液，吸取供试液2 mL，按上述线性关系中测定方法，从“水浴下挥去溶剂”开始测定吸光度，计算RSD值。

(3)稳定性试验。按1.2项下太子参皂苷供试液制备的方法，制备皂苷供试液，吸取供试液2 mL，按上述线性关系中测定方法，从“水浴下挥去溶剂”开始，每隔20 min测定1次吸光度，计算RSD值。

(4)重复性试验。按1.2项下太子参皂苷供试液制备的方法，平行称取6份太子参药材，制备太子参皂苷供试液，吸取供试液2 mL，按上述线性关系中测定方法，从“水浴下挥去溶剂”开始，测定吸光度并计算RSD值。

(5)加样回收率试验。称取已知总皂苷含量的样品粉末0.05 g(过7号筛)，平行称取5份，分别加入相同质量的人参皂苷Rb1标准品0.4 mg。按1.2项下太子参皂苷供试液制备的方法，制备皂苷供试液，取供试液2 mL，按上述线性关系中测定方法，从“水浴下挥去溶剂”开始，测定吸光度，计算平均回收率以及RSD值。

2 结果与分析

2.1 显色系统筛选

由于太子参总皂苷的含量是以人参皂苷Rb1标准品标定的，在选择显色系统时要综合考虑人参皂苷Rb1和太子参皂苷供试液对显色系统的灵敏性及稳定性。由试验结果可知(表2)，显色系统②的灵敏性与稳定性都相对最高，因此，选定②号显色系统进行测定。即:向已挥干溶剂的供试液具塞试管中加入5%香草醛－冰醋酸溶液0.2 mL，摇匀后，加入60%硫酸溶液5 mL，混合均匀后于60℃水浴中保温20 min，取出冷水冷却后于560 nm处测定吸光度。

表2 显色系统考察结果Tab.2 Results of color conditions inspection

2.2 正交试验结果

由单因素考察试验可知，当选定提取溶剂后，药材颗粒度、料液比、提取时间3个因素对总皂苷含量影响较大，因此，以这3个因素设计了L9(34)3因素3水平的正交试验，结果见表3。从表3可见，A2B3C3为较优的总皂苷供试液制备条件，即太子参总皂苷供试液制备方法为:称取太子参药材粉末0.1 g(过药典7号筛)，加入无水乙醇20 mL，超声提取120 min，过滤后，取续滤液5 mL于蒸发皿中，水浴蒸干后，用甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，作为供试液。

2.3 线性关系与方法学考察结果

2.3.1 线性关系 以人参皂苷Rb1对照品溶液浓度(μg/mL)为横坐标，测得的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线(图1)。得到回归方程:A=0.017 6C+0.011 3，R2=0.999 5，线性范围:7.94～40.89 μg/mL。

表3 正交试验结果Tab.3 The results of orthogonal test

图1 人参皂苷标准曲线Fig.1 The standard curve of ginsenside Rb1

2.3.2 精密度试验 按1.2项下太子参皂苷供试

液制备的方法，制备太子参供试液，连续测定5次，吸光度分别为0.155、0.152、0.156、0.154、0.154，计算得到RSD值为0.96%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 稳定性试验 按1.2项下太子参皂苷供试液制备的方法，制备太子参供试液，分别测定0、20、40、60、80、100 min时的吸光度，分别为0.155、0.152、0.154、0.156、0.154、0.155，计算得到RSD值为0.88%，表明该测定方法于1 00 min内稳定。

2.3.4 重复性试验 按1.2项下太子参皂苷供试液制备的方法，平行称取6份同一批次太子参药材，制备太子参供试液，测定皂苷含量。计算得到RSD值为1.97%(表4)，表明该方法重现性良好。

2.3.5 加样回收率试验 平行称取5份已知皂苷含量的同一产地太子参药材，分别加入人参皂苷0.4 mg，按1.2项下太子参皂苷供试液制备的方法，制备太子参供试液，测定皂苷含量。计算RSD值为1.25%，平均回收率为98.82%(表5)，表明该方法准确度良好。

表4 重复性试验结果Tab.4 Results of repeatability test

表5 加样回收率试验结果Tab.5 Results of sample recover test

3 讨论

3.1 太子参皂苷不仅具有增强免疫力等药理作用［1］，其含量还可以在一定程度上表征太子参生长的环境变化［9］，因此，太子参的皂苷含量在太子参的质量控制中具有重要作用。目前，由于太子参皂苷在测定中缺少自身标准品，所测得的含量多为一种模糊值，使太子参的质量控制受限。本试验得到的超声波半微量提取测定法，较其他方法具有快捷、灵敏、取样少等优点，在缺少太子参皂苷标准品的测定研究中，具有一定的应用价值。但若想使太子参皂苷作为一个指标性成分在太子参质量控制中得到更好的应用，还需要在太子参皂苷标准品方面深入研究。

3.2 超声波是一种机械波，在不均匀介质中传递时会发生散射衰减，试验超声提取时，样品整体作为一种介质在各方向上是不均匀的，到达样品内部的超声机械能量会有一定程度的衰减，从而影响提取效果［4］。本试验采用0.1 g的药材用量，其原因:一是可以使药材不受震动、摇晃等影响，在250 mL的具塞锥形瓶中都能平铺于瓶底，堆积厚度较小，降低了超声波的衰减;二是使试剂对样品内部的浸提作用更充分;三是当药材用量较小时，可以在一定程度上忽略杂质干扰。

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