酶法分离纯化猪血血红素的工艺及应用研究进展

2013-10-23庞美霞綦菁华黄漫青

武汉轻工大学学报 2013年2期

庞美霞，綦菁华，王芳，黄漫青，王伟

(1.北京农学院食品科学与工程学院，北京 102206;2.石家庄卫生学校，河北石家庄 050061)

猪血是一种可以大量获得的营养价值很高的工业副产品，其中蛋白质含量18.9%，比鸡蛋高6.2%，比大米高12.7%，因此猪血被人们誉为“液态肉”［1］。猪血由血细胞和血浆两部分组成，血浆蛋白含量约占全血蛋白含量的25%，血浆蛋白容易制取，可通过离心、干燥制得，因此被广泛用于肉类、布丁、香肠等食品中。而血细胞蛋白—主要是血红蛋白，由于色泽猩红，具有腥味和不易消化，应用受到限制［2］。

我国每年的生猪产量居世界第一，占世界生猪产量的一半，猪血资源非常丰富，每年获得的血量在90万t以上［2］，但目前仅用来制造饲料用血粉及血豆腐、血饼等附加值较低的产品，因此对猪血的利用很低。很多猪血被直接排放入环境中，造成环境污染。我国从20世纪80年代开始研究猪血的综合利用，目前文献报道了利用猪血开发血红素、蛋白粉、凝血酶和超氧化物岐化酶(SOD)的研究［3-4］。

血红素是含铁卟啉化合物，具有重要的生理功能，应用广泛。目前血红素的提取方法主要是有机试剂法，既污染环境，毒性也大，因此国内外一直在研究新的血红素提取方法。近年来，很多人利用酶技术提取畜禽血液中的血红素。从猪血中酶法提取血红素，将会产生较好的经济效益和社会效益［5］。

1 血红素、血红蛋白的结构特征和性质

血红素是动物肌肉和血液中的主要色素，在肌肉中主要以肌红蛋白(myoglobin，Mb)形式存在，在血液中主要以血红蛋白(hemoglobin，Hb)形式存在。血红蛋白是由两条α－球蛋白多肽链和两条β－球蛋白多肽链组成的四聚体，因此具有四级结构，由四个亚基组成。每个亚基由一条多肽链与一个血红素相连接，4个亚基之间由盐键连接。肌红蛋白是只有三级结构的单链蛋白质，与血红蛋白各亚基结构极为相似。血红蛋白和肌红蛋白均是典型的携氧蛋白［6］。

血红素是一种亚铁卟啉化合物。四个吡咯环由四个α-碳原子通过四个次甲基(—CH=)桥相连形成卟吩环，Fe2+位于环中，与吡咯环上的氮原子结合成四个配位键，从而形成亚铁卟啉环，血红素分子式为C34H33FeN4O4，分子量为633.49。亚铁原子与球蛋白分子组氨酸残基上的咪唑环上的氮原子形成第五个配位键，与各种配基的电负性原子结合形成第六个配位键。血红素及血红蛋白结构见图1。血红素为片状或针状的紫色结晶，不溶于水、稀酸、醚、氯仿及丙酮，溶于氢氧化钠水溶液、热或氨水中［7，8］。血红蛋白溶解性好，有很强的乳化能力，并能形成稳定的泡沫。

2 血红素制备工艺

目前工业中主要利用有机溶剂法生产血红素(包括冰醋酸法和酸性丙酮法)［9］。冰醋酸法是血液与冰醋酸及少量NaCl，KCl等共热得到血红素结晶。此法收率低，1升血液只可得3—4 g血红素结晶，提取温度高，蛋白和溶剂难回收［10］。酸性丙酮法是根据血红素与珠蛋白在pH3.0附近结合最疏松的原理分离血红素的。加入盐酸丙酮溶液，血红素与珠蛋白脱离，亚铁血红素变成氯化血红素且溶于酸性丙酮中，珠蛋白变性沉淀。根据后序工艺不同酸性丙酮法可分为醋酸钠法、蒸馏法、稀碱抽提法、鞣酸盐析法［9］。

图1 只有主链骨架而没有侧链的血红蛋白的二级结构

此外近些年在实验室还有人用CMC法、表面活性剂法、酶解法等方法制备血红素。CMC法是利用CMC吸附血红素与血红蛋白分离的。表面活性剂法是在盐酸酸化的血红蛋白中加入表面活性剂，加热，氯化血红素沉淀出来［9］。利用蛋白酶提取血红素是最环保的一种方法。

3 蛋白酶法制备血红素工艺研究进展

3.1 原理及工艺流程

在新鲜血液中添加抗凝剂，离心分离得到红细胞，破碎红细胞，用各种蛋白酶在其最适条件下将血红蛋白上的珠蛋白水解，肽链断开，水解液中有血红素肽、血红素和肽片段，除去不需要的肽，得到血红素复合体。以动物血液作原料，将红细胞用大量水稀释，调pH，用蛋白酶进行水解，将珠蛋白和血红素分离［9，11］，工艺流程见图 2。

图2 酶法制备血红素工艺

3.2 蛋白酶的选择及血红素酶法提取工艺研究进展

用于水解蛋白质的酶按来源分有三种:植物蛋白酶(如菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶)、动物蛋白酶(如胰蛋白酶)和微生物蛋白酶。目前在我国酶法提取血红素还处于实验室研究阶段。选出成本低廉的蛋白酶，采用最简单的方法制备血红素是研究的热点。

瞿桂香等［12］研究了4种蛋白酶，以血红素提取率为考察指标，按影响程度从大到小的顺序是碱性蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞中性蛋白酶＞胰蛋白酶。张亚娟［11］分别选用6种酶以及复合酶水解血红蛋白，然后用三氯乙酸沉淀四肽以上片段，再测定上清液280 nm下的吸光度值，吸光值大小反应蛋白质的水解率，通过此方法确定碱性蛋白酶的水解能力最强，其次是中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶，风味酶，复合酶水解效果也较好，但低于碱性蛋白酶。杨锡洪等［13］先加中性蛋白酶，再加风味蛋白酶制备了亚铁血红素肽。杨萍等［14］用木瓜蛋白酶和AS1398中性蛋白酶复配生产补血活性肽。张纯丽［2］用木瓜蛋白酶∶中性蛋白酶=6∶4制备血红素肽。

3.3 血红素纯化方法

血红素纯化的方法一般采用有机溶剂重复提取法或硅胶柱纯化［15，16］，但这些方法生产成本高，且污染环境。现在有实验室研究用超滤，酸化，凝胶层析等方法纯化血红素酶提取液。

周淡宜，徐水祥［17］利用血红素不溶于水和醋酸的特性，将碱性提取液酸化，血红素析出，然后经过过滤、干燥得纯品。张亚娟［11］将酶解液用盐酸调pH至4.0，4 000 rpm/min离心15分来纯化血红素，所得粗品纯度23%。杨锡洪等［13］将水解产物经10 kDa微孔滤膜超滤后，滤过液再经3 kDa滤膜超滤，收集第二次的滞留液，主要得到分子量分布为9982、6918和3951三个组分，制得亚铁血红素与肽的比值为9.92%的富亚铁血红素肽。

李艳伟［18］将胰蛋白酶水解的酶解液反复超滤后，通过Sephadex G－25凝胶层析、阳离子交换层析制得抗菌肽。

3.4 前处理——破碎红细胞

酶解前必须破碎红细胞。目前已发展了多种细胞破碎方法，主要分为机械法和非机械法两大类。机械法有高压匀浆破碎法、高速搅拌珠研磨破碎法、超声波破碎法等;非机械法主要有渗透压冲击破碎法、冻融破碎法、酶溶破碎法、利用酸、碱、表面活性剂和有机溶剂的化学破碎法。猪血酶法提取血红素目前主要是加水溶胀红细胞和超声波破胞。

杨锡洪等［13］加红细胞3倍体积的蒸馏水，搅拌下溶胀破壁。真空脱气，避光条件下60℃加热30 min，3 000 r/min离心15 min，去除变性的杂蛋白等，得到血红蛋白溶液。刘振荣等［19］首次将超声波技术用于丙酮法提取氯化血红素，加水量为离心后红细胞体积的1/5，超声波溶血时间为10 min，提取时间为15 min。王长瑞等［20］用超声波酶法提取血红素，最佳工艺条件为红细胞与水的比例5∶1，破碎功率 185.34 W，时间8.76 min。

3.5 酶解中注意的问题——亚铁离子的保护

酶解中血红素亚铁离子易被氧化成高铁离子［21］，血红蛋白液由红色变为褐色。因此，在酶解时要加入适量的抗氧化剂来保护亚铁血红素，从而得到色泽理想的亚铁血红素肽。李芳等［22］研究乙氧喹和Vc对血红素标准品的抗氧化效果，结果表明乙氧喹在实验初期对亚铁血红素有良好的抗氧化性能，而Vc则具有持久的抗氧化性能，Vc/乙氧喹复合型抗氧化剂具有明显优于单一型抗氧化剂的抗氧化性能。杨锡洪等［13］酶解后，经过真空脱气、充氮，并添加茶多酚和异抗坏血酸钠保护亚铁离子。

4 酶解肽的功能及应用

4.1 血红素肽的功能及应用［23］

血红素铁可预防和改善营养性贫血。因此可将血红素肽添加到饼干、巧克力、糖果、面包、酱油等食品中作营养强化剂。

血红素也是一种天然色素，添加在肉类食品中可作发色剂。在火腿、灌肠、午餐肉等肉制品中加入血红素肽，可取代亚硝酸盐及人工合成色素，使肉制品产生鲜艳红色，增加食品的安全性。

在医药工业，血红素是半合成法制备胆红素的前体，而胆红素是制备人工牛黄和抗癌药的重要原料。

4.2 血红蛋白多肽的功能

目前从食品蛋白质的酶解物中发现了一些小分子肽，包括抗高血压肽、免疫调节肽、抗血栓肽、抗菌肽、抗癌肽，活性肽的开发是功能性食品研究最活跃的领域之一。Kazue等酶解猪血红蛋白得到了4种具有抑制ACE活性，降血压的活性肽［24］。张艳梅等将血红蛋白酶解液脱色，经Sephadex G-100凝胶层析纯化，提取到了抗菌肽。方俊等［25］试验结果表明猪血多肽具有较强的抗氧化作用。