阿托伐他汀对兔动脉粥样硬化斑块的干预作用

马晔，马建芳，关瑞锦

动脉粥样硬化（AS）是一种炎症性慢性疾病，炎症微环境对血管内皮生长因子（VEGF）的表达有显著影响，并与炎症细胞共同参与炎症过程[1,2]。新生血管是AS斑块发展进程中的重要伴随现象，VEGF作为新生血管形成的中枢调节因子，对其分化成熟及血管形成起着重要的调控作用。本研究通过动物实验观察AS兔模型血脂和VEGF的表达以及阿托伐他汀对其干预作用的相关性。

1 材料和方法

1.1实验动物健康雄性新西兰大白兔20只，（2～3）月龄，体重约（1.3～2.1）kg，清洁级，购自上海生旺实验动物有限责任公司。饲养许可证SYXK （军）2007-031。室温（18～22）℃，湿度（50±10）%。

1.2主要仪器、试剂盒和药品兔TC、TG、LDL-C和VEGF ELISA试剂盒（武汉基因美生物科技有限公司）；Biozol Reagent、RNase free ddH2O[BIOER（杭州）]；多聚赖氨酸Sigma；VEGF一抗（武汉基因美）；羊抗兔二抗（invitrogen）（中杉金桥）；BIOZOL总RNA提取试剂、BioRT cDNA 第一链合成试剂盒、BioEasy SYBR Green I 荧光PCR试剂盒（杭州博日）；HM315R切片机（德国）；PCR仪（ABi美国）；生物显微镜（Nikon Eclipse 55I，彩色数字CCD）；阿托伐他汀钙片（辉瑞公司）。

1.3实验方法

1.3.1实验动物分组20只新西兰雄性大白兔，随机平均分为对照组、模型组、低剂量阿托伐他汀组和高剂量阿托伐他汀组，对照组采用普通饲料（100g/d）；后三组均采用高脂饲料，配方为普通饲料84%+10%蛋黄粉+1%胆固醇+5%猪油，喂养4W后用球囊损伤腹主动脉，模型组不采用任何处理，低剂量阿托伐他汀组采用阿托伐他汀5 mg/（kg.d），高剂量阿托伐他汀组采用阿托伐他汀10 mg/（kg.d）。

1.3.2兔腹主动脉粥样硬化模型的建立术前禁食12小时并称重，予硫酸阿托品（0.03 mg/kg）肌肉注射，盐酸氯氨酮注射液（11.5 mg/kg）联合速眠宁Ⅱ（6 mg/kg）麻醉动物后，固定四肢和头部，暴露右股动脉，结扎远端，近端用丝线阻断血流，用Terumo corporation桡动脉穿刺针成功穿刺股动脉后，在DSA透视下送入Runthrough导丝，再沿导丝将（3.0～4.0）mm RuJin球囊导管送至主动脉弓处，注入碘普罗胺注射液，加压（10～18）atm充盈球囊且阻力适中，回拉至髂总动脉，反复回拉3次造成动脉内膜损伤。

1.3.3血脂及VEGF测定分别在0W、6W、12W采血5 mL，用ELISA法检测血清TG、TC、LDL-C、VEGF水平。12W后空气栓塞处死实验兔，自髂动脉分叉以上（1～2）cm处至膈肌下1 cm左右处剪下腹主动脉，采用Western Blotting检测斑块内VEGF蛋白含量，荧光定量PCR检测VEGF mRNA的表达。引物信息：VEGF正向引物5'CGATCGAGACCTTGGTGGACAT 3'反向引物5'TGCATGGTGACGTTGAACTCCT 3'；GAPDH正向引5'ACCCATCACCATCTTCCAGGAG 3'反向引物5'GAAGGGGCGGAGATGATGAC3'。

1.4统计学分析应用PEMS3.1统计软件进行数据分析，计量资料以（均数±标准差）表示。多组间均数比较采用t检验，组间两两比较采用SNK－q检验。

2 结果

12w后通过腹主动脉血管彩超、血管大体标本及血管病理组织学评价兔动脉粥样硬化程度，期间模型组因感染死亡1只，高剂量组因腹泻死亡1只。

2.1各组兔不同时间点血脂和VEGF水平分别于第0w、6w和12w检测不同组兔血LDL-C、TG、TC和VEGF水平。与对照组相比，模型组、低剂量他汀组、高剂量他汀组在6w和12w的血LDL-C、TG、TC、VEGF均显著增高（P＜0.01）。与模型组比较，他汀组血LDL-C、TG、TC、VEGF在第6w和12w明显降低，但高剂量他汀组降低更为明显（P＜0.05，表1）。

2.2各组兔动脉血管内膜病理学改变对照组动脉内皮完整，无脂质沉积；模型组内皮增生、增厚，管腔明显变窄，有大量泡沫细胞和脂质沉积，中膜变薄；他汀组血管内膜不同程度增厚和泡沫细胞形成（图1）。

2.3各组兔AS斑块内VEGF蛋白表达与对照组比较，模型组AS斑块中VEGF的表达显著增高（P＜0.01）。与模型组比较，他汀组VEGF在AS斑块中的表达均降低。但高剂量他汀组较低剂量他汀组降低更明显（表1）。

2.4各组兔AS斑块内VEGF mRNA的表达与对照组比较，模型组及他汀组VEGF mRNA的表达水平更高（P＜0.01）。他汀组可降低兔AS斑块VEGF mRNA的表达水平（P＜0.05）。与低剂量他汀组比较，高剂量组的效果更为明显（P＜0.05，表1）。

3 讨论

血脂异常是动脉粥样硬化发生发展的重要因素，血浆中的LDL-C是沉积在动脉硬化斑块中的主要脂质成分。血管壁内及动脉粥样硬化损伤处的细胞氧化LDL-C产生氧化修饰的LDL-C，后者聚合吞噬细胞并被其吞噬形成泡沫细胞以形成脂质条纹，进一步发展为动脉粥样硬化斑块。本研究表明高脂饲料喂养兔在第6w和12w血清TG、LDL-C、TC水平均逐渐显著增高。

图1 各组兔动脉内膜病理学改变（HE染色，20×；a：对照组；b：模型组；c：低剂量阿托伐他汀组；d：高剂量阿托伐他汀组）

血管内皮在正常情况下能够防止血栓形成和血小板粘附，调节血管的舒缩状态，阻碍炎症细胞的浸润等。本研究采用球囊损伤血管内皮，内皮功能异常是动脉粥样硬化的始动因素，而动脉粥样硬化又可加剧内皮功能的损伤。采用高脂饲料喂养联合球囊损伤血管内皮可致血管通透性增加，进一步导致大量脂质沉积血管内膜下，触发LDL成OX-LDL。兔腹主动脉HE染色可见内皮增生、增厚，斑块隆起，血管管腔明显变窄，可见许多脂肪空泡，有大量巨噬细胞，淋巴细胞等浸润。斑块表面有纤维组织覆盖，弹力纤维断裂、溶解、胶原明显增生，平滑肌细胞排列紊乱。中膜变薄，外膜可见毛细血管增生，具有典型的AS改变，此结果与国内相关研究结果一致[3-6]。VEGF是一种与血管增殖密切相关的多肽生长因子，是最直接的血管内皮细胞促分裂素。AS斑块中存在多种炎症介质、趋化因子，其共同作用使斑块中VEGF的表达上调[7]。血管内皮细胞是VEGF主要靶器官，研究表明其在体内外均具有促进内皮细胞增殖、迁移、出芽及血管腔形成等功能[8]。且外源性VEGF也可促进AS斑块形成[9]。

表1 不同时间各组兔血脂和VEGF水平

阿托伐他汀是强效的降脂药物，除降脂外，他汀类药物在稳定动脉粥样硬化斑块、防止血栓形成、改善血管内皮功能、抑制血浆炎症因子等方面均发挥着重要作用[10,11]。本研究显示，高剂量和低剂量阿托伐他汀组较模型组血清TG、LDL-C、TG水平显著降低，动脉粥样硬化病变程度较轻；同时高剂量阿托伐他汀能更有效降低AS斑块内VEGF mRNA水平。多项研究表明，负荷剂量的阿托伐他汀在降脂、稳定粥样斑块、抗炎方面优于常规剂量，并具有剂量依赖关系[13,14]。阿托伐他汀通过降低VEGF及相关蛋白的表达，延缓甚至逆转AS的进展。因此，阿托伐他汀可以减少斑块内血管生成，达到稳定斑块的作用[15]。ARMYDA-ACS研究[16]正是基于充分应用他汀类药物的调脂外作用的基本理论并获得明显效果。

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