石灰性土壤中高效磷细菌群解磷动力学研究

张 健，洪坚平

（山西农业大学资源环境学院，山西太谷030801）

除了施用化学磷肥以外，施用能够分解土壤中难溶态磷的解磷细菌肥料，使其在作物根际形成一个磷素供应较充分的微区[2]，从而改善作物磷素营养，提高作物的生物量和产量[3]，也是一个重要途径。而微生物肥料或菌剂能使失去微生物活性的土壤重新建立和恢复土壤微生物体系[4-5]，开展解磷高效微生物的研究与应用，对于挖掘土壤磷资源的利用潜力、节约磷肥投入、降低生产成本、保护我国磷矿资源和农业高效持续发展具有重要的理论意义和实践意义[6]。

磷细菌的解磷变量是在活细胞的作用下变化的，动力学要研究这种变化规律以及各种条件对这些变量变化速度的影响以及影响其速率的各种因素，从而获得相关信息，可反映细胞适应环境变化的能力[7]。这一研究有助于我们更加深入地认识和掌握磷细菌菌肥对活化土壤、增加磷营养的可给性方面的研究[8]。磷细菌单菌株的解溶磷效果比较单一，而且效果相对有限，但目前，磷细菌群的研究相对较少。

本试验将从石灰性土壤中分离鉴定出的5种磷细菌进行组建，通过建立化学动力学方程对组建的解磷菌群进行动力学研究，从而得到不同磷细菌群解磷动力学曲线和动力学方程，旨在为磷细菌生物肥料更好地被应用于生产提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 供试材料

试验所用菌株为山西农业大学资源环境学院微生物实验室从石灰性土壤中分离鉴定出的5种磷细菌，即有机磷细菌：蜡状芽孢杆菌（B.cereus）、巨大芽孢杆菌（有机）（Bacillus megaterium）、黄杆菌（Flavobacterium）；无机磷细菌：假单胞菌（Pseudomonas）、巨大芽孢杆菌（无机）（Bacillus megaterium）。

1.2 菌株培养基[8]

无机磷细菌培养基：葡萄糖10g，（NH4）2SO40.5g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，FeSO4·g，蒸馏水1 000 mL。

有机磷细菌培养基：葡萄糖10 g，NaCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，KCl 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，蒸馏水1 000 mL，蛋黄液30 mL（无菌生理盐水与鸡蛋黄1∶1配制），调节pH值至7.2～7.4。

1.3 试验设计

根据菌种类型组建的6个磷细菌群分别为：G1.蜡状芽孢杆菌＋巨大芽孢杆菌（无机）），G2.蜡状芽孢杆菌＋假单胞菌；G3.黄杆菌＋巨大芽孢杆菌（无机）；G4.黄杆菌＋假单胞菌；G5.巨大芽孢杆菌（有机）＋巨大芽孢杆菌（无机）；G6.巨大芽孢杆菌（有机）＋假单胞菌。

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1.4 试验方法

1.4.1 不同磷细菌群解磷动力学曲线的建立 将50 mL培养基（有机磷细菌和无机磷细菌各25 mL）装入100 mL三角瓶中，加0.5 g磷矿粉，每瓶接磷菌群1 mL，共16瓶，30℃摇床培养。每隔24 h随机取出2瓶，共培养8 d，分别取菌液测定速效磷含量和活菌数量，测定结果取其平均值。

1.4.2 不同磷矿粉量对磷细菌群转化有效磷的影响 将50 mL培养基（有机磷细菌和无机磷细菌各25 mL）装入100 mL三角瓶中，分别加入0.063，0.125，0.250，0.500，1.000，2.000 g 磷矿粉，30 ℃摇床振荡培养，5 d后取出，测定菌液速效磷含量，测定结果取其平均值。同时以未接菌的含磷矿粉培养基为空白对照（CK）。

1.5 测定项目及方法

有效磷的测定采用钼蓝比色法[9-10]；全磷的测定采用H2SO4-HClO4消煮钼蓝比色法[9]；细菌菌数的测定采用平板计数法[10]；磷细菌群解磷动力学方程的建立，采用Monod方程的非结构模型和发酵动力学中的生长关联型模型及其数学拟合法[10]。

2 结果与分析

2.1 不同磷细菌群解磷动力学曲线的建立

以时间为横坐标、有效磷量为纵坐标，得到各个解磷菌群解磷动力学曲线如图1所示。其反映了各菌群的解磷能力对时间的依赖关系。由图1可知，随着解磷时间的延长，所有磷细菌群处理下的有效磷数量不断增加，尤其在前5 d，增加率较大，5 d后增加率趋于平缓。这可能是由于菌体将部分无机磷转化为菌体中的结构磷所致。郑传进[11]研究得出，巨大芽胞杆菌对无机磷中磷的释放在第5天和第7天达到最大值，以后渐达平衡。G3（黄杆菌＋巨大芽孢杆菌（无机））的解磷能力相对其他菌群处理较高，是本试验所需的最佳组合，说明黄杆菌和巨大芽孢杆菌（无机）有较好的协同作用，这是由于5 d后巨大芽孢杆菌解磷能力下降，而黄杆菌的解磷能力没有明显下降[3]，所以，这2种解磷菌在发挥最大解磷能力的时间上互相补充，并且巨大芽孢杆菌和黄杆菌所释放的磷酸酶和有机酸能互相协同螯合金属离子，使难溶磷溶解出来[12]。

2.2 不同培养时间对不同磷菌群活菌数的影响

从表1可以看出，随着培养时间的延长，各解磷菌群处理的活菌数均有所增加，其中，G3处理的活菌数增加最快，G2，G5处理次之。

表1 不同处理的磷细菌活菌数 ×107个/mL

各菌群随时间变化的磷细菌数量和有效磷形成量如图2所示。

从图2可以看出，随着培养时间的延长，磷细菌群菌体生长量与有效磷的产生量呈现一定的正相关性，即有效磷与菌群活菌数均随培养时间的延长而有所增加。

对于磷细菌来说，提高解溶磷的效果，最主要是通过增加磷细菌的数量来实现。磷细菌生物肥料含菌数一般为108～109个/g菌肥，通过施用磷细菌菌肥可增加土壤内磷细菌数量，实现土壤有效磷增加的目的。另外，使得磷细菌获得较高的生长速率也是增加磷细菌数量的有效途径，也可以达到提高磷溶解速度的目的。Breet等[13]研究指出，植物和细菌的生长动力学相互关联，因为他们的生长被同一种营养源限制，主要是有效磷。从图2还可以看出，培养初期，磷细菌刚接种到培养基中，处于适应期，此时有少量有效磷存在（这些磷源可供磷细菌生长）；适应期过后，磷细菌快速生长进入对数生长期，并在其生长代谢过程中迅速将无效磷转化为有效磷；随着培养时间的延长，有效磷的含量也逐渐升高；培养中期磷细菌进入生长稳定期，活菌数增长比较缓慢；到培养后期，磷细菌生长进入衰亡期，活菌数急剧下降，有效磷的含量稳定在一定的水平。刘丽丽[14]研究指出，当磷细菌生物肥施入田间时，在磷细菌和植物根系形成的微生态中，植物根部的脱落物和分泌物不断地向磷细菌提供营养，加速其生长，而解磷反应的产物不断地被植物吸收，根际微生态中的溶磷动力学的平衡点向形成产物的方向移动，从而刺激植物快速生长。微生物生态学家认为，土壤内的微生物一般来说是处于饥饿状态，外界提供营养的情况会很大程度上影响微生物的生长，所以，当磷细菌生物肥料中磷细菌在植物根部定植下来以后，对磷细菌来说植物提供的营养条件是限制其生长的主要因素[15-16]。

2.3 不同磷细菌群解磷动力学方程的建立

从表2可以看出，随着提供的底物磷矿粉量的增多，不同磷细菌群转化有效磷的数量在增加。说明在一定的范围内，提供的底物磷矿粉越多，磷细菌群转化有效磷的数量就越多。以磷矿粉量为横坐标，以培养液中的有效磷量为纵坐标，可得到菌群的无效磷转化曲线，以G1为例，如图3（曲线A）所示。

表2 不同磷矿粉量对磷细菌群转化有效磷的影响 mg/L

由无效磷转化动力学曲线（图3）得到动力学方程:

式中，Y为有效磷量，X为细菌浓度，a为转化常数，b为特征常数。

由（1）得：11.83＝alg1＋b

由（2）得到：a＝4.74，b＝11.83。

即G1的无效磷转化有效磷的动力学方程为：

方程经拟合验证：

由图3可知，用试验数据与模型计算值进行验证比较，模型计算（曲线B）与试验结果（曲线A）拟合良好。

同样方法得出，G2无效磷（磷矿粉）转化动力学方程为：Y＝3.7lgX＋13.65；G3无效磷（磷矿粉）转化动力学方程为：Y＝28.29lgX＋45.99；G4无效磷（磷矿粉）转化动力学方程为：Y＝9.13lgX＋18.92；G5无效磷（磷矿粉）转化动力学方程为：Y＝27.62lgX＋45.99；G6无效磷（磷矿粉）转化动力学方程为：Y＝3.39lgX＋12.40。

从6个菌群无效磷（磷矿粉）转化动力学方程可以看出，G3方程中转化系数和特征常数的值最大，说明G3（黄杆菌和巨大芽孢杆菌（无机）的组合）处理的无效磷转化有效磷的能力最强。模型正确地反映了磷细菌群的产物形成过程及其动力学机制[17]，说明通过对初选出的6组高效解磷菌群进行比较，得出黄杆菌和巨大芽胞杆菌对无效磷的转化有很好的协同作用，这2种磷细菌相互促进各种产物的形成，对有效磷的增加有很好的效果。

Sperber等[18]研究结果表明，根际微生物的活性及其群落结构对植物磷素营养影响很大，在这个过程中，磷细菌群可以将无效磷转化为植物营养磷，并且随磷细菌数量增加而增加，随土壤中全磷特别是无效磷（磷矿粉）量增加而增加；在施用磷细菌生物肥后，将对活化土壤、增加磷营养的可给性带来很大改善[11]；有些种类的磷细菌除了具有解磷活性，在植物根际还能够分泌一定量的植物激素，对作物生长具有刺激作用[19]。因此，大力推广使用磷细菌生物肥料能克服大量使用化肥所带来的环境污染问题，并通过微生物的修复作用，可改善土壤环境、促进持续农业的发展。

3 结论

本研究结果表明，各磷细菌群处理下的有效磷数量随培养时间的延长不断增加，尤其在前5 d的增加率较大，5 d后增加率趋于平缓。在不同磷水平下，底物浓度越高，磷细菌群的转化有效磷量越大，其中，黄杆菌和巨大芽孢杆菌（无机）组合转化有效磷含量相对较高，无效磷（磷矿粉）转化动力学方程为：Y＝28.29lgX＋45.99，且在磷矿粉为2 g时，有效磷含量最高，达到50.24 mg/L。

本试验中的磷细菌群是由2种类型的磷细菌组成，其内部作用机理比单菌株的解溶磷机理更为复杂，试验通过综合各测定指标得出，黄杆菌和巨大芽孢杆菌（无机）的组合有较高的生长速率，对无效磷的转化起到相对较好的作用，这为更好地研制磷细菌生物肥料提供了理论依据。

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