短肽RADA16-1自组装纤维长度与止血关系研究

李佳楠，钟小忠，王 婷

（1.江汉大学 生命科学学院生物技术系，湖北 武汉 430056； 2.成都大学，四川 成都 610041）

临床外科手术止血，尤其是在中枢神经系统外科手术中如何快速止血是一个难点。快速止血可使流血所造成的神经组织继发性损伤降低，减少病人神经系统的损伤。而在之前的研究中，有报道使用自组装短肽溶液可以在实验动物不同组织中完成快速止血的现象，完全止血时间小于20 s［1］。该过程未借助压力，烙烧，血管收缩，凝结和交联附着物（cross-linked adhesives）等传统的外科止血方法［2-4］。这种快速止血效果对神经外科手术中减少流血对神经组织的损伤以及野外急救有着极其重要的意义。并且，已有实验证明该短肽溶液可以减少中枢神经组织急性创伤后的神经细胞凋亡（TUNEL法）［5］。

在本研究中，自组装短肽RADA16-1自组装形成的长纤维首先通过超声处理破坏，通过圆二色谱仪、原子力显微镜和流变仪研究了自组装短肽RADA16-1在水溶液中的自组装动力学特征。同时，以SD大鼠脊髓全横断（T8）和肝脏横切作为创伤出血模型，统计短肽溶液的止血时间，分析短肽纤维长度及形成的水凝胶的黏度与止血时间的相关性。该研究可对了解短肽自组装过程和自组装短肽止血机理，完善RADA16-1的止血应用开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 短肽样品制备

短肽RADA16-1分子式为RADARADA⁃RADARADA（RADA16-1），由上海波肽多肽合成实验室合成和纯化（该多肽分子量为1712 ku，纯度大于95%）。实验前短肽RADA16-1用去离子水溶解至终浓度1%，再经超声处理1 min后用0.22 μm的滤膜过滤，无菌分装室温保存备用。

1.2 圆二色谱（CD）检测样品的准备

将合成的短肽RADA16-1稀释至终浓度为90 μmol/L（0.15 mg/mL）的肽溶液作为 CD 测试液。光谱扫描范围190～260 nm，扫描速度10 nm/3 s，所得数据用OriginPro 7.0作出谱线。圆二色谱使用的CD仪为AVIV MODEL 400。

1.3 原子力显微镜扫描及自组装分析

使用日本精工SPA400型原子力显微镜扫描云母表面上样品，为DFM模式。所用探针为硅探针，型号是SI-DF20，悬臂长度是200 μm，工作频率是127 kHz，弹性系数是12 N/m。扫描采用的分辨率为512×512像素的表面形貌图和相图。扫描参数设置如下：频率≈123 kHz，啮合前抖动振幅≈1V，积分增益0.1～0.3，比例增益0.02～0.1，扫描速度1～2 Hz。

在新揭开的云母表面滴5 μL短肽溶液，15 s后用100 μL去离子水冲洗3次，室温晾干。取样点分别是超声处理前，超声后2、30、120、240、1440 min。样品表征后应用离线软件随机测量每个取样点图中15根纤维的长度，计算每个时间点纤维的平均长度。

1.4 材料流变学分析

样品黏弹性使用流变仪进行测定（AR2000，TA Instruments），取200 μL短肽溶液样品放置在流变仪托盘上，使用脂真空密封。在1 Hz恒定频率时测量水凝胶储能模量（G′），测试时间为1 min。取样时间点同原子力显微镜表征。

1.5 脊髓损伤止血动物模型

成年SD大鼠，鼠龄17～32天，雌雄不限，由江汉大学医学院医学实验动物中心提供。该中心获得湖北省科学技术厅颁发的《实验动物使用许可证》（许可证号：syxk（鄂）2012-0042，有效期为2012.3.5-2017.3.4）实验经过江汉大学医学伦理委员会批准，严格遵守实验动物处理的伦理学标准，尽可能减少实验动物的痛苦及使用数量。用戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔注射麻醉，于手术显微镜下在大鼠胸椎T8～T10的位置背侧椎板切除暴露对应段位脊髓，使用眼科手术刀对脊髓T8进行全横断，切断后迅速将1%的不同时间点自组装短肽溶液50 μL注射入创口，用于创口出血控制，记录完全止血时间。空白对照组以生理盐水处理。实验动物每组6只（n=6），实验组分为：空白对照组，超声处理前，超声后2、30、120、240、1440 min组。

1.6 肝创伤止血动物模型

成年SD大鼠，以戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔注射麻醉，腹部去毛备皮，10号手术刀切开老鼠腹部，暴露肝脏。使用15号手术刀在最大一叶肝脏切开1 cm长深0.5 cm切口。迅速将1%的不同时间点自组装短肽溶液200 μL注射入创口，用于创口出血控制，记录止血时间。空白对照组以生理盐水处理。实验动物每组6只（n=6），实验组分为：空白对照组，超声处理前，超声后2、30、120、240、1440 min组。

2 结果

2.1 圆二色谱分析

圆二色谱结果显示，超声前后短肽RA⁃DA16-1均为明显的β-折叠构象（图1），提示超声处理未改变短肽单体分子内构象，且超声后β-折叠特征峰（216 nm）的轻微变高显示更密集的β-折叠聚集，说明超声处理未破坏短肽RADA16-1单体分子结构。

图1 自组装短肽RADA16-1超声处理前后的圆二色谱（CD）

2.2 自组装短肽的自组装过程原子力表征

原子力显微镜表征实验结果见图2，结果表明RADA16-1可以自组装成长度约（786.34±96.54）nm的长纤维（图2A）。为研究纳米纤维结构的稳定性，RADA16-1水凝胶使用超声处理1 min，以破坏长纤维。原子力显微镜表征显示，超声后2 min短肽RADA16-1自组装形成的长纤维被折断成平均长度（21.22±5.45）nm的短纤维（图2B）。随超声处理后时间的增加，这些折断的短纤维具有自组装能力，最终自组装成长度约（615.4±103.54）nm的长纤维（图2F：超声处理后1440 min）。以上超声处理后原子力显微镜表征实验重复3次，3次实验均得到近似的实验结果，折断的短纤维具有自组装成长纤维的能力，且该过程可重复。

图2 超声处理前后自组装短肽RADA16-1的原子力显微镜表征图

2.3 流变力学分析

该实验重复3次，实验结果取平均值±标准差。每次实验中，均可观察到水凝胶储能模量（G′）从超声后2 min的6 Pa上升到超声后240 min的36.5 Pa，且超声后1440 min时间点水凝胶的储能模量（G′）达到50 Pa，结果见图3。

图3 流变力学分析结果

RADA16-1动态自组装的纤维长度变化和RADA16-1形成的多肽水凝胶的储能模量统计结果显示，自组装纤维长度和水凝胶储能模量相关（P＜0.05）。

2.4 脊髓创伤与肝脏创伤止血实验

椎板切除后，在胸段T8的位置使用眼科手术刀对脊髓进行全横断，将超声前以及超声后不同时间点的50 μL 1%浓度短肽RADA16-1水凝胶滴注进创口，记录止血时间。超声前和超声后1440 min水凝胶样本可以在20 s内完成止血。而对照的生理盐水组和超声后2 min实验组，完全止血时间大于180 s。在肝脏左叶横切后，使用200 μL 1%浓度的不同时间点水凝胶滴注进创口。超声前和超声后1440 min实验组均在20 s内完成止血。而对照的生理盐水组和超声后2 min实验组，完全止血时间大于300 s，结果见图4。

图4 短肽材料止血效果分析

3 讨论

已知短肽RADA16-1在水溶液中呈稳定的β-折叠结构，β-折叠是RADA16-1能够自组装的结构基础。超声前后的CD检测显示溶液中短肽为明显的β-折叠特征，即短肽RADA16-1的结构未因超声发生改变［6］，同时分析CD结果，发现超声后溶液中存在β-折叠聚集的现象，该结果与Yokoi等［4］的实验结果相同，分析原因可能是溶液中RADA16-1单体和超声折断的自组装长纤维通过非共价键的自发聚集行为［7］。

原子力显微镜扫描分析显示自组装短肽RA⁃DA16-1形成的纳米纤维长度由几百纳米到几微米之间。超声后纤维断裂成长度小于50 nm的短纤维。短纤维重组装的动力学在超声后2、30、120、240、1440min被测定。结果显示，纤维的重组装表现出时间相关性：到24 h，重组装形成的纤维长度与原有纤维长度近似，长度（615.4±103.54）nm。重组装过程中，组装速度表现出的呈时间相关的先快后慢的特征，可能是由于超声后产生的短纤维的浓度效应［8］。同时实验还发现，重组装纤维长度的增加与水凝胶流变学特征的改变呈对应关系。储能模量随超声后时间的增加达到最后G′＞45，相对应的自组装纤维长度达到600 nm，即纤维越长，水凝胶的储能膜量G′越高。论及实验基础。

短肽RADA16-1的完全止血可以在约20 s完成，该过程不同于传统的止血方式。通过研究短肽RADA16-1的自组装动力学过程和分析止血实验，本研究发现短肽自组装成的纤维长度越长，其止血时间越短，可以将短肽RADA16-1溶液止血的机制归纳如下：①超声将RADA16-1自组装形成的长纤维打断成短纤维，而超声后不同时间点的RADA16-1溶液止血所消耗的时间随着纤维自组装增长而缩短。到1440 min止血平均时间约20 s，已经接近超声前RADA16-1完成止血需要的平均时间。②长纤维为水凝胶提供了较高的储能膜量，使水凝胶更能耐受血液脉搏的压力［9］。对止血过程进行分析发现，超声后早期时间点短纤维止血耗时长，水凝胶的储能模量低，胶体易碎，会出现血液冲破水凝胶而导致止血失败的情况。而超声后1440 min和超声前的RA⁃DA16-1在创口内形成的水凝胶，均表现出一定的弹性，胶体可随脉搏出现波动，但无血液冲破水凝胶的情况发生。③短肽RADA16-1单体含精氨酸和谷氨酸残基，使短肽自组装形成的纤维带电荷，带电荷的纤维可通过静电作用与创口很好地黏合［10］。

本实验对短肽RADA16-1自组装成长纤维的时间动力学变化特点及其与止血功能之间的关系的研究，有助于更好地理解该型短肽的物理化学特点，为完善RADA16-1的止血应用开发提供理

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