虾红素的提取及稳定性研究

李 露，沈慧兰，张 蓓，韦荣编，宋 茹

（1．浙江海洋学院东海科学技术学院，浙江舟山 316004；2．浙江海洋学院海洋科学与技术学院，浙江舟山 316004；3．浙江海洋学院食品与医药学院，浙江舟山 316004）

虾红素(astaxanthin)，又称虾青素，化学名称为 3,3’－二羟基－4,4’－二酮基－β,β’－胡萝卜素，是海洋生物体内主要的类胡萝卜素之一[1]。虾、蟹甲壳类动物壳中含有丰富的虾青素，在加热后则变为红色。研究表明虾红素除具有超强的抗氧化能力外，还具有抗肿瘤、降血糖、缓解体力疲劳等多种生物活性[1-8]。所以，虾红素在功能性食品、医药等方面具有广泛的应用前景。虽然雨生红球藻Haematococcus pluvialis中虾青素含量高达干重的3%～5%[9]，但是沿海城市养殖虾蟹种类多，且产量大，所以从虾蟹壳中提取虾红素具有资源上的优势。

本文对舟山本地主要养殖品种南美白对虾Penaeus vannamei、三疣梭子蟹Portinus trituberculatus以及食用量大的克氏原鳌虾Procambarus clarkii壳中虾红素的光谱特征分别进行分析，并系统研究了保藏条件、加热温度和时间、pH对虾红素稳定性影响，旨在为虾蟹壳中虾红素的综合应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

海产虾壳（南美白对虾）和海产蟹壳（三疣梭子蟹）从当地水产市场收集，克氏原鳌虾的虾壳主要收集尾部虾壳；乙醇为分析纯试剂。

1.2 主要仪器与设备

HHS型电热恒温水浴锅，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；DGG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱，上海森信实验仪器有限公司；DJ-04型中药粉碎机，上海淀久中药机械制造有限公司；G80F23MSXLVIIA7K型格兰仕微波炉，格兰仕集团；RE-5285A型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；UV-1200UV型紫外可见分光光度计，日本日立公司；TGL-16C离心机，上海安亭科学仪器厂。

1.3 实验方法

1.3.1 不同来源的虾红素提取

从水产市场收集的虾、蟹壳分别用清水刷洗干净，上蒸笼蒸熟变红色，将熟制的虾、蟹壳烘干后掰成小块，再用中药粉碎机进行破碎处理，得到虾、蟹壳干粉备用。将南美白对虾、三疣梭子蟹和克氏原鳌虾壳的干粉分别按照1：10比例与乙醇混合，参考文献[10]虾红素提取方法进行提取，然后7 000 r/min离心10 min，取各自上清液在200～600 nm下进行光谱扫描，分析不同来源虾红素的特征吸收峰。

1.3.2 提取方法对虾红素的影响

分别采用超声辅助提取、微波萃取和常规水浴提取法来提取蟹壳红素（主要成分为虾红素），其中蟹壳粉与提取剂（无水乙醇）比例为1：10，超声辅助提取和常规水浴提取温度为70℃，提取时间为15 min，微波萃取时间为20 s（因加热时间长，乙醇易挥发），将提取物离心（7 000 r/min，10 min），取上清液测定虾红素特定波长下的吸光值。

1.3.3 虾红素的稳定性分析

1.3.3.1 保藏条件对虾红素稳定性影响

将提取好的虾红素分别在不同条件下（室温暴光，室温避光，4℃冷藏，-20℃冷冻）放置一定时间（65 h），分析测定虾红素紫外可见扫描光谱及特征吸收值变化。

1.3.3.2 加热温度和时间对虾红素稳定性影响

将提取好的虾红素上清液分别在80、90、100℃下水浴加热15 min和30 min，测定虾红素特定吸收波长下吸光值变化。

1.3.3.3 pH对虾红素稳定性影响

将提取好的虾红素上清液用酸（HCl）和碱（NaOH）调节 pH 值为 1、2、3、4、5、6、7、8 和 9，室温下放置30 min，然后7 000 r/min离心10 min，取上清液测定虾红素特征吸收波长下的吸光值变化。

1.4 数据统计

虾红素稳定性分析中数据采用平均值±标准差表示（n=3）。

图1 不同来源的虾红素特征吸收光谱Fig.1 Characteristic absorption spectrum of astaxanthin from different sources

2 结果与分析

2.1 不同原料虾红素的特征吸收波长

分析了舟山市养殖规模大的海产虾（南美白对虾）、海产蟹（三疣梭子蟹）、海产虾蟹壳混合物及食用量大的克氏原鳌虾壳中虾红素在相同提取条件下的紫外可见扫描光谱，结果如图1所示。

图1紫外可见扫描光谱显示不同原料的虾红素谱图有相似处，均在可见光区473 nm左右有特征吸收峰，而在紫外光区280 nm附近出现的吸收峰或肩峰应与虾蟹壳中残留的蛋白质被提取出来有关。另外，由图1还可以看出克氏原鳌虾在473 nm处的吸光值明显高于南美白对虾、三疣梭子蟹和海产虾蟹壳混合物的吸光值，说明克氏原鳌虾壳中虾红素含量高。

2.2 不同提取方法对虾红素的提取效果影响

在动植物色素提取中，快速辅助提取方法中的微波萃取法由于微波能由内向外快速加热特性，会促使胞内水分快速汽化沸腾，结果破坏了细胞壁的完整结构，促使胞内成分快速溶出。而超声辅助提取中超声波产生的空化作用也会对细胞壁有破坏作用，所以微波萃取和超声波提取较常规萃取方法更能有效地提取出动植物组织中色素，并且提取时间短，工作效率高。试验比较了微波萃取、超声辅助提取及常规水浴法（在相同提取条件下）所得虾红素的紫外可见光谱，结果如图2所示。

从图2可以看出，微波萃取、超声辅助提取所得的虾红素与常规水浴法所得虾红素的紫外可见扫描图谱形状相似，分别在可见光区的473 nm和紫外光区的280 nm、220 nm有特征吸收峰，其中可见光区吸收与红色素有关，而紫外区280 nm的特征峰除了与蛋白吸收峰有关外，也可能是在280 nm附近有吸收的氨基酸，如：色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，或者是由这些氨基酸构成的肽类被提取，或蛋白质在加热过程中降解释放这些氨基酸有关，而220 nm处吸收主要与肽键特征吸收有关。

通过比较虾红素在473 nm吸光值大小可知：超声辅助提取法对虾红素的萃取效果好于同提取条件的常规水浴法，而微波萃取法则和同条件下的水浴提取法差别不明显。乙醇作为虾红素提取剂在微波快速加热时非常容易挥发，试验设置的提取时间很短可能对提取效果有一定影响，所以微波萃取的优势尚未充分发挥出来，拟在日后进一步改进微波萃取条件，提高虾红素的提取效果。

图2 不同提取方法对虾红素提取效果影响Fig.2 Effects of different extracting methods on the extraction effect of astaxanthin

2.3 虾红素的稳定性分析

2.3.1 保藏条件对虾红素稳定性影响

测定虾红素提取液在室温暴光、室温避光、4℃冷藏和-20℃冷冻条件下保藏65 h后473 nm处吸收值变化情况，结果如图3所示。

图3 不同保藏方式对虾红素稳定性影响Fig.3 Effects of different storing methods on the stability of astaxanthin

从图3可以看出，在室温条件下经一定时间保藏（65 h）后，与对照相比无论是室温暴光还是室温避光保存，虾红素在473 nm的吸光值都略有降低。4℃冷藏条件下虾红素的吸光值与对照相比也稍微降低，但是与室温保藏条件下虾红素特征吸光值相比则无明显差别，而在冻藏条件下（-20℃）保藏的虾红素在473 nm处吸收值则要明显高于对照组。试验中发现虾红素提取液经冷冻保藏后再解冻会在溶液底部有部分沉淀形成，经过离心处理弃去沉淀，虾红素的纯度会增高，所以在473 nm处的吸光值增加。图3结果表明当有大量虾红素提取液需要长期保藏时，可以选取-20℃冷冻保藏法。

2.3.2 加热温度和时间对虾红素稳定性影响

将海产蟹壳粉末与无水乙醇按照1：10（w/v）混合，70℃水浴提取90 min，离心后得上清液，测定不同加热温度和加热时间下虾红素的特征吸光值变化，结果见如4所示。

图4结果显示80℃下加热基本不会影响虾红素的特征吸光值，当加热温度提高到90℃，加热时间达到30 min时，虾红素在473 nm的吸光值开始上升，而在加热温度100℃，时间超过15 min后，吸光值的增加更为明显。虽然在加热过程中采用锡箔纸对试管口进行密封处理，但在100℃加热条件下，虾红素溶液会沸腾汽化，仍然有部分溶剂挥发损耗掉，而且加热时间越长，溶剂损耗量也就越大，结果虾红素浓度增大造成吸光值增高。但是可能还会有另外一种情况，即：加热温度高，虾红素提取液中某些杂质被破坏程度大，结果提高了虾红素的有效浓度。图4结果也能说明虾红素对食品加工中常见的加热处理稳定性较高，而100℃下加热30 min后虾红素在473 nm处特征吸光值急剧增加的具体原因还需要借助其它分析方法作进一步分析。

2.3.3 pH对虾红素稳定性影响

不同pH下溶液中阳离子或阴离子与色素发生相互作用，改变了色素的化学结构，结果色素在不同pH下呈现的颜色会发生改变，甚至会发生褪色或变色现象。根据不同pH值下虾红素在473 nm特征吸光值变化来判定pH值对虾红素稳定性影响，结果如图5所示。

图5结果显示在pH为4时，虾红素在473 nm处的吸光值最高达到1.332，而pH为9时最低只有0.515，降低了2倍以上。此外，由图5还可以看出除了pH为5外，虾红素在酸性条件下均表现出较高的吸光值，说明酸性条件下虾红素的稳定性高。当介质pH为接近5时，虾红素溶液中会有部分红色颗粒凝聚，经离心处理后沉积在离心管底部，结果上清液在473 nm处的吸光值降低。后经证实絮状红色沉淀物为蛋白质和虾红素的聚集物（具体数据未列出），所以图5中pH为5时虾红素溶液在特征波长处的吸光值降低与部分虾红素被絮凝沉淀有关。因此，虾红素作为天然食品添加剂使用应尽量避免pH为5介质条件，以免溶液发生分层现象。

图4 加热温度和时间对虾红素稳定性影响Fig.4 Effects of different heating temperature and time on the stability of astaxanthin

图5 pH对虾红素稳定性影响Fig.5 Effects of different pH values on the stability of astaxanthin

3 结论

海产虾（南美白对虾）、海产蟹（三疣梭子蟹）及克氏原鳌虾壳虾红素在473 nm左右均有特征吸收峰，而且超声辅助提取法有利于虾红素的快速提取。虾红素提取液在－20℃冷冻保藏稳定性高，食品中常见的常压加热处理对虾红素稳定性影响不大，虾红素在偏酸性条件下（pH＜5）稳定性高。

[1]陈志强,任 璐,江慎华,等．虾青素降血糖作用的研究[J]．食品科学,2008,29(7):402－404．

[2]杨 艳,周宇红,徐海滨,等．虾青素抗氧化作用动物实验研究[J]．现代预防医学,2009,36(13):2 432－2 433．

[3]裴凌鹏．虾青素体内抗肿瘤及其免疫调节作用的实验研究[J]．上海中医药杂志,2009,43(6):68－69．

[4]陈东方,王海玉,李 立,等．天然虾青素缓解体力疲劳作用的实验研究[J]．中国现代医学杂志2010,20(17):2 567－2 569．

[5]AMARO H M,BARROS R,GUEDES A C,et al．Microalgal compounds modulate carcinogenesis in the gastrointestinal tract[J]．Trends in Biotechnology,2013,31(2):92－98．

[6]ANARJAN N,TAN C P,NEHDI A I,et al．Colloidal astaxanthin:Preparation,characterisation and bioavailability evaluation[J]．Food Chemistry,2012,135(3):1 303－1 309．

[7]NAGARAJ S,RAJARAM M G,ARULMURUGAN P,et al．Antiproliferative potential of astaxanthin－rich alga Haematococcus pluvialis Flotow on human hepatic cancer(HepG2)cell line[J]．Biomedicine&Preventive Nutrition,2012,2(3):149－153．

[8]YAO C,DU L,JIN Z Y,et al．Storage stability and antioxidant activity of complex of astaxanthin with hydroxypropyl－β－cyclodextrin[J]．Carbohydrate Polymers,2013,91(1):385－389．

[9]刘晓娟,伍颖华,何凤林,等．响应面法优化雨生红球藻中虾青素的提取条件[J]．食品科技,2012,37(2):235－238．

[10]冯伟栋,杨益波,宋 茹．花蟹壳红色素提取工艺优化[J]．粮油食品科技,2012,20(4):60－63．