水产品中3种氯霉素类药物残留的超高效液相色谱-串联质谱测定法研究

梅光明 ，陈雪昌 ，张小军 ，刘 琴 ，李佩佩 ，何依娜 ，郭远明

（1.浙江海洋学院海洋与渔业研究所，浙江省海洋水产研究所，浙江舟山 316100；2.浙江省海水增养殖重点实验室，浙江舟山 316100）

氯霉素（Chloramphenicol，简称CAP）是一种有效的广谱抗生素，曾广泛应用于食用动物的疾病预防与防治。甲砜霉素（Thiamphenicol，简称TAP）和氟苯尼考(Forfenicol，简称FFN)为氯霉素的衍生物，抗菌谱和应用范围与氯霉素也基本相同。临床试验表明食品中残留的以上3种氯霉素类药物能使人体产生再生性造血功能障碍以及致命的”灰婴综合症”等毒副作用，其中以氯霉素毒性最强[1-3]。氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的化学性质都极为稳定，在曾经用药的食用性动物组织中很容易产生药物残留。为保障食品安全，目前各国对这3种氯霉素类药物在食品中的残留限量都做了严格规定。欧盟(EEC)96/23指令中将CAP列入禁用药，并且规定氯霉素MRPL(minimum required performance limits)值为0.30 μg/kg，甲砜霉素MRL(maximum required limits)值为50 μg/kg,氟苯尼考的MRL值为100～2 000 μg/kg。目前水产品中的氯霉素类药物检测方法主要包括酶联免疫法[4-5]、液相色谱法[6]、气相色谱法[7-8]、气质联用法[9-10]和液质联用法[11-13]。酶联免疫法易产生假阳性结果，气相色谱法和气质联用法需化学衍生化步骤，操作过程繁琐复杂，因而液质联用法成为氯霉素类药物残留量测定和结构确认的最佳方法。本试验采用超高效液相色谱—串联三重四级杆质谱仪测定水产品中的氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考，结合同位素内标法回收率高、定量定性准确可靠等特点，可以实现大批量样品的氯霉素类药物快速准确检测。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Waters Acquity超高效液相色谱；Premier XE三重四级杆质谱仪（配电喷雾ESI离子源）；SL-502N型台式天平；AL204型电子天平；IKA T18基本型组织捣碎机；德国IKA漩涡振荡器；Eppendorf 5810台式高速离心机；R-201型旋转蒸发仪。

甲醇、无水乙酸铵、乙酸乙酯，均为色谱纯。

乙酸铵溶液（5 mmol/L）：称取0.385 g无水乙酸铵溶解于适量水中后定容至1 000 mL。

氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考标准储备液：称取适量纯度大于98%的氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考标准品，分别用甲醇溶解并定容，配成100 μg/mL的标准储备液，-18℃避光保存1年。

混合标准储备溶液：分别准确吸取1.0 mL氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考标准储备液，用甲醇稀释并定容至100 mL，配成1.0 μg/mL的混合标准储备液，-18℃避光保存6个月。

混合标准使用液：分别准确吸取10.0 mL和1.0 mL的混合标准储备溶液，用甲醇稀释并定容至100 mL，配成100 ng/mL和10 ng/mL的混合标准使用液，-18℃避光保存3个月。

内标标准储备液：准确吸取100 μL的1.0 mg/mL氘代氯霉素（D5_CAP）标准溶液，用甲醇溶解并定容10 mL，配成1.0 μg/mL的内标标准储备液，-18℃避光保存6个月。

内标标准使用液：准确吸取10.0 mL的内标标准储备溶液，用甲醇稀释并定容至100 mL，配成100 ng/mL，-18℃避光保存3个月。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 液相色谱条件

色谱柱：Acquity UPLC BEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流动相：5 mmol/L 乙酸铵溶液（A）+甲醇(B)，梯度洗脱条件见表 1；柱温：40 ℃；进样量：10 μL。

表1 流动相梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution programme of mobile phase

1.2.2 三重四级杆质谱条件

离子化模式：电喷雾离子源（ESI），负离子模式；毛细管电压：3.50 kV；离子源温度：120℃；脱溶剂气温度：380 ℃；脱溶剂气流量：600 L/h；锥孔气流量：50 L/h；扫描模式：多反应监测（MRM），驻留时间：0.15 s。反应监测母离子、子离子、锥孔电压和碰撞能量见表2。

表2 选择反应监测母离子、子离子和碰撞能量Tab.2 Parent ions,daughter ions and collision energy of MRM

1.3 样品前处理

称取绞碎的鱼糜样品3.0 g于50 mL聚丙烯离心管内，加入100 μL内标标准使用液、15 mL乙酸乙酯和0.45 mL氢氧化铵后涡旋振荡提取2 min，再加入5.0 g经450℃下烘干过的无水硫酸钠，再次涡旋振荡2 min，6 000 r/min离心5 min，上清液移入100 mL鸡心瓶中。残渣中再加入15 mL乙酸乙酯，漩涡振荡提取2 min，6 000 r/min离心5 min，上清液合并入鸡心瓶中。45℃下旋转浓缩至干，加入2 mL的5 mmol/L乙酸铵溶液-甲醇(V/V，90+10)超声5 min以充分溶解残渣，加入5 mL正己烷涡旋混合30 s，40℃水浴中静置5 min，6 000 r/min离心5 min分层后弃掉上清液，再加入5 mL正己烷重复操作1次，最后取1 mL样液经0.22 μm有机相滤膜过滤后上机分析。

2 结果与分析

2.1 提取与净化

氯霉素类药物属于弱极性物质，易溶于有机溶剂，可用甲醇、乙腈、丙酮和乙酸乙酯等有机溶剂提取。通过比较甲醇、乙腈和乙酸乙酯3种溶剂提取效果，结果表明采用甲醇和乙腈作为提取溶剂的添加回收率较低，3种氯霉素类药物的添加回收率均在60%以下，而采用乙酸乙酯作为提取溶剂时添加回收率可达到70%以上，这与文献[14-15]报道的乙酸乙酯对氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的提取效率最高的结论一致。PFENNING等[16]发现提取液中加入少量的氨水对虾等水产品具有更高的提取效率。本实验采用碱化乙酸乙酯提取，浓缩后用正己烷脱脂两次，可以有效去除水产品中的脂肪等杂质，上机分析结果表明MRM色谱图基质干扰较小，回收率较高，满足水产品中氯霉素类药物分析检测要求。

2.2 色谱条件选择

本研究采用UPLC快速分离氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考，每个样品在3 min以内全部出峰，利用流动相梯度洗脱程序可以实现3个目标峰有较好的分离度。另外3种氯霉素类物质在电喷雾负离子模式下（ESI-）的离子响应强度比正离子模式下（ESI+）要高，通过在流动相中添加乙酸铵，可以进一步增加负离子模式下的离子响应强度，并改善峰型。

2.3 质谱条件选择

在负离子模式下，用质谱蠕动泵在20 μL/min的流速下分别注入1.0 μg/mL的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氘代氯霉素标准溶液,在母离子扫描（MS Scan）模式下，m/z在 150～750扫描范围内以进行一级质谱图扫描,确定氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氘代氯霉素的分子离子，并比较不同锥孔电压下的母离子强度，确定每个母离子有最大响应值时的最佳锥孔电压值。在最佳锥孔电压下，通过子离子扫描（Daughter Scan）模式下确定每种氯霉素类药物的碎片离子，并选择响应强度较高的2个子离子作为定量离子和定性离子，同时对碰撞电压进行优化，确定碎片离子有最大响应强度时的最佳碰撞电压值。优化后的参数见表2。在最佳质谱条件和色谱条件下，3种氯霉素类药物混合标准品的UPLC-MS/MS色谱图如图1所示。

2.4 基质效应的消除

由于分析物的共流出组分影响电喷雾接口的离子化效率，因而ESI离子源易受基质效应的影响，产生离子增强或离子抑制。当基质效应影响大时，会降低方法的灵敏度，影响方法的准确性。为最大限度消除基质效应干扰，本试验采用基质匹配法进行定量分析。以空白鱼糜样品的提取液为标准溶液的稀释溶液，可使标准溶液和样品溶液具有相同的离子化环境，再结合采用氘代氯霉素作为内标物定量，从而较好地消除基质效应。空白草鱼样品添加标准溶液后测定图谱如图2所示。

图1 2.00 ng/mL的CAP、TAP和FFN混合标准溶液MRM色谱图Fig.1 MRM chromatogram of CAP,TAP and FFN mxied standard solution(2.00 ng/mL)

2.5 线性范围与检出限

取适量3种混合标准使用液，用空白鱼糜样品提取液（提取时不加入内标物）稀释配置成浓度分别为0.10、0.25、0.50、1.00、2.00、5.00、10.0、20.0 和 50.0 ng/mL的标准工作溶液，同时加入内标标准使用液，使内标物浓度均为5.00 ng/mL，进样后以目标组分与内标物的峰面积比值Y对相应的质量浓度X(ng/mL)绘制标准曲线。通过添加标准品配制一定浓度的鱼肉样品，经前处理和检测后，以S/N=10时为分析方法的定量检出限。3种氯霉素类药物的线性方程、相关系数和定量检出限见表3。

2.6 准确度和精密度

以空白草鱼和对虾为测试对象，考察样品3个梯度浓度加标下测定结果的准确度和精密度。实验结果见表4，表4结果表明氯霉素在加标量0.10～2.00 μg/kg范围内，平均回收率为84.7%～104.9%；甲砜霉素在加标量0.50～10.0 μg/kg范围内，平均回收率为88.2%～104.1%；氟苯尼考在加标量0.50～10.0 μg/kg范围内，平均回收率为91.9%～104.1%；且测定结果的批内相对标准偏差均小于15%，结果表明该方法准确度和精密度完全可以满足水产品中氯霉素类药物残留检测的要求。

图2 草鱼空白2.00 μg/kg CAP、TAP和FFN加标样品测定MRM色谱图Fig.2 MRM chromatogram of blank grass crap meat spiked with 2.00 μg/kg CAP,TAP and FFN

表3 3种氯霉素类药物的测定线性方程、线性范围、相关系数和定量检出限Tab.3 Regression equations,linear range,correlation coefficients,and Quantitation limits of 3 chloramphenicol drugs

2.7 实际样品测定

结合本单位承担的农业部2012年流通环节鲍鱼质量安全普查任务工作要求，课题组从北京、杭州和福州等城市的农贸市场、批发市场和超市采集了各品种鲍鱼样品共50份，对氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的残留量进行检测分析，结果中2个样品检出含有氟苯尼考，检测值分别为14.3 μg/kg和2.01 μg/kg。

3 结论

本试验建立了超高效液相色谱-串联质谱法测定水产品中3种氯霉素类药物残留量，结合基质匹配标准曲线定量法和同位素内标法的优点，较好地消除了基质效应，方法前处理过程简便快捷，检测结果准确度高、精密度好，在大批量实际样品的检测中取得了满意的结果。

表4 空白样品中添加CAP、TAP和FFN的回收率和相对标准偏差（n=6）Tab.4 Recoveries and relative standard deviations of CAP,TAP and FFN in spiked samples(n=6)

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