乙型病毒性肝炎患者检测HBV基因分型、耐药变异的价值和意义

陈海雁 张桂花 魏威 罗锦彬 黄舒婷

乙型病毒性肝炎患者检测HBV基因分型、耐药变异的价值和意义

陈海雁 张桂花 魏威 罗锦彬 黄舒婷

目的通过一体化鉴定探讨乙肝病毒肝炎患者HBV基因分型和耐药变异的临床价值与意义。方法选取本院收治的73例乙肝病毒肝炎患者，以拉米夫定为首选治疗药物，以阿德福韦酯和恩替卡韦为耐药患者替代治疗药物；所有患者均取清晨空腹静脉血，利用 MassARRAY Assay和实时定量PCR 技术进行基因分型和耐药变异测定，对其用药情况进行为期3年的追踪分析。结果基因分型：本组病例包括B型40例(54.79%)、C型32例(43.84%)、及D型1例(1.37%)，未见其他基因分型患者。耐药变异：在为期3年的追踪治疗中，共发生耐药变异33例(45.21%)，其中B型变异率27.5%(11/40)，C型变异率68.75%(22/32)，D型无变异，各基因型之间差异有统计学意义(P<0.05)；治疗1、2、3年的耐药变异率分别为3例(4.11%)、9例(27.27%)、21例(63.64%),随着治疗时间的延长显著升高(P<0.05)；B型基因以YVDD变异为主，占81.82%(9/11),其余2例为YIDD变异(18.18%)，C型基因均为YIDD变异，其变异类型差异有统计学意义(P<0.05)。结论乙肝病毒肝炎患者HBV基因分型和耐药变异具有一定的相关性，对乙型病毒性肝炎的抗病毒治疗效果有一定影响，利用MassARRAY Assay高通量技术建立HBV基因分型、耐药变异、前C区/BCP区突变检测技术，可为乙型病毒性肝炎的临床诊治提供指导性策略。

HBV基因分型；耐药变异；MassARRAY Assay；核苷(酸)类似物

1 资料与方法

1.1一般资料 ①研究对象:选取本院2008年1月至2009年12月收治的73例乙型病毒性肝炎患者为研究对象；其中男47例，女26例，年龄34～51岁，平均(41.7±6.4)岁。②主要仪器:基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪(MALDL-TOF-MS, Sequenom)；实时荧光定量PCR仪(7500FAST, ABI)； 低温超重离心机(AllegraTM 64RCentrifuge, BECKMAN)

1.2研究方法 治疗方法:所有患者入院后均给予常规营养支持和保肝治疗；在此基础上，以拉米夫定为首选抗病毒药物，并以阿德福韦酯和恩替卡韦为耐药患者替代治疗药物。②基因测定方法:①标本采集:采取清晨空腹肘静脉血3 ml，4℃冰箱过夜；并以4℃、4000r/min离心分离血清，-20℃保存。DNA提取和PCR 扩增:常规煮沸法提取血清DNA，由Assay Designer软件包设计PCR引物；采用 MassAR-RAY TM Analyzer 技术平台进行 HBV-DNA P 区检测。a.常规:PCR条件：体系：灭菌双蒸水1 μl；10×PCR buffer 0.625 μl；2.5 mmol dNTP 1 μl；引物 1 μl；HotStar Taq 酶 0.1 μl。温度：42℃ 5 min， 95℃ 3 min；(94℃ 15 s， 55℃ 25 s， 72℃ 50 s，40个循环)； 72℃ 7 min。b.测序:PCR 条件：体系：灭菌双蒸水1 μl；iPLEX buffer 0.2 μl；终止混合物 0.2 μl； iPLEX 酶 0.041 μl；引物 0.804 μl。温度：94℃，2 min；(94℃，5 s； 52℃，5 s； 80℃，5 s；40 个循环)72℃， 3 min。③序列分析:MassARRAY Nanodispenser处理PCR终产物，并用MALDL-TOF-MS仪进行基因分析；使用 MassARRAYRT 软件系统实时读取分析结果。

1.3统计学方法 所得数据以构成比或百分率表示，采用 SPSS 17.0 进行χ2检验；检验标准： α=0.05。

2 结果

2.1基因分型 本组病例包括B型40例(54.79%)、C型32例(43.84%)、及D型1例(1.37%)，未见其他基因分型患者。

2.2耐药变异 在为期3年的追踪治疗中，共发生耐药变异33例(45.21%)，其中B型变异率27.5%(11/40)，C型变异率68.75%(22/32)，D型无变异，各基因型之间差异有统计学意义(P<0.05)；治疗1、2、3年的耐药变异率分别为3例(4.11%)、9例(27.27%)、21例(63.64%),随着治疗时间的延长显著升高(P<0.05)；B型基因以YVDD变异为主，占81.82%(9/11),其余2例为YIDD变异(18.18%)，C型基因均为YIDD变异，其变异类型差异显著(P<0.05)；见表1。

表1 乙肝病毒耐药突变情况

3 讨论

干扰素和核苷(酸)类似物为乙肝治疗的两大主体药物，基于仅20%～30%的 HBeAg 阴性患者对干扰素有应答，且干扰素治疗有一定的肝毒性，其适用范围较窄，效率相对较低。核苷(酸)类似物具有给药途径便捷，病毒抑制效应强，毒副作用小等优势，在乙肝的治疗中取得了显著疗效，尤以拉米夫定使用最为广泛[2]。然而，基于其HBeAg 血清学转换率低，存在乙肝病毒耐药性变异现象，长期疗效不佳，为目前限制其抗乙肝病毒治疗疗效的主要因素[3]。

本文应用MassARRAY Assay技术[4]，对乙肝病毒的基因分型及患者药物治疗过程中的病毒变异耐药位点做一体化鉴定研究；结果显示，45.21%的患者可发生耐药变异，随着用药时间的延长，变异率准年升高，且C基因型的变异率显著高于B基因型。部分文献报道表明[5]，B基因型应用拉米夫定的持久有效性显著优于C基因型，与本院研究结果有较强一致性。本研究结果提示，基因型对抗病毒疗效的影响是与耐药变异的发生密切相关的。提示早期HBV YMDD变异检测对拉米夫定抗病毒长期疗效有预测作用。

综上所述，乙肝病毒肝炎患者HBV基因分型和耐药变异具有一定的相关性，对乙型病毒性肝炎的抗病毒治疗效果有一定影响，利用MassARRAY Assay高通量技术建立HBV基因分型、耐药变异、前C区/BCP区突变检测技术，在充分发挥高通量优势的同时，又可实现检测自动化和集成化。可同时检测多个突变位点，针对多个耐药位点同时分析，为乙型病毒性肝炎的临床诊治提供指导性策略。

[1] 李华建,丁伯敬,王嵘嵘.乙型肝炎病毒(HBV)耐药基因突变检测研究.现代预防医学,2012,39(19):5066-5067，5070.

[2] 覃霞,杭晓峰,徐文胜,等.急性乙型肝炎患者血清HBV基因耐药变异及相关因素分析.肝脏,2012,17(12):843-845，886.

[3] 谭朝霞,汤影子,况雪梅,等.核苷类似物干预下慢性乙型病毒性肝炎患者HBV多聚酶区基因突变检测分析.重庆医学,2011,40(13):1254-1256.

[4] 王春霞,甄宏斌,朱文鹏,等. MassARRAY技术高通量检测乙肝病毒C区/C启动子区基因变异.现代预防医学,2012,39(22):5920-5923.

[5] 刘映霞,位兴辉,罗志雄,等.乙型肝炎患者HBV基因型与核苷(酸)类似物耐药变异的关系.中华实验和临床感染病杂志(电子版),2007,1(2):86-91.

516211 惠州市惠阳区人民医院检验科(陈海雁 张桂花 罗锦彬 黄舒婷)；南方医科大学生命科学学院(魏威)

乙型病毒性肝炎为我国发病率较高的传染病之一，基于乙肝病毒传播途径广泛，其传染率居于各类传染病前列。研究结果显示[1]，乙型病毒性肝炎病情迁延，无有效根治手段，随着发病程度的加深，可发展为肝硬化、肝癌等严重器质性病变，给家庭、社会造成沉重的经济负担。目前，抗病毒治疗是控制其病情进行性扩展的主要手段，以干扰素类和核苷(酸)类似物为其两大主治药物。基于干扰素的适用面窄，治疗效率相对偏低，临床多以核苷(酸)类似物为主。研究表明，病毒耐药性变异为制约核苷(酸)类似物临床疗效的主要障碍，惠州市惠阳区人民医院以MassARRAY Assay技术为依托，对本地区常见乙肝病毒的基因分型和耐药位点做鉴定分析，以期为抗病毒疗效评价和用药方案的调整提供依据。