GSTM1基因多态性与肺癌相关性研究

暨南大学医学院第三附属医院 广东省珠海市人民医院（519000）陆奇凯

肺癌是环境和遗传因素相互作用的多因素、多阶段恶性肿瘤性疾病[1]。肺癌是当前癌症死亡的主要病因之一，其死亡率增加和吸烟密切相关[2]。近年来，随着分子生物学技术的突飞猛进和分子流行病学的发展，肺癌相关遗传因素的研究越来越受到重视，陆续发现了可能致病的相关基因[3]。

体外实验研究表明，GSTM1编码缺失基因导致致癌物在体内的代谢障碍可能是肺癌发生过程中的一个重要环节，提高了患肺癌的风险。此外，GSTM1基因可影响烟草中含有的一种亚硝胺化合物——4-甲基亚硝胺-1（3-吡啶）-丁酮所诱导的遗传毒性作用及其并发的与吸烟相关的健康效应。本研究通过对GSTM1基因多态性与环境暴露因素和肺癌易感性关系进行研究，为探索肺癌的发病机制及其诊断、防治提供理论依据。为吸烟、不良的生活习惯、职业暴露因素等可增加肺癌的罹患率提供理论支持。

1 材料和方法

1.1 研究对象 肺癌病例来源于2005年9月～2011年7月期间在广东省珠海市人民医院经影像学检查，痰脱落细胞，支气管冲洗液中找到癌细胞，外科手术切除并经病理学确诊的91例原发性肺癌患者为研究对象。按肺癌的TNM分期分类。对照组138例是来自于上述医院的健康体检人员。

1.2 实验方法

1.2.1 血液标本收集 空腹采集研究对象（病例/对照）的外周静脉血5ml，所收集的血样立即送试验室分离白细胞和血清，分别装入塑料离心管中放在-20℃冰箱中保存备用，血清备用，血细胞用于提取DNA。

1.2.2 改良酚-氯仿法提取血液基因组DNA

1.2.3 采用PCR–RFLP技术检测GSTM1基因多态性 引物设计：两对引物（见附表1）分别特异性扩增GSTM1基因片断（215bp）及参照基因β-globin（β-珠蛋白、268bp）。引物由上海生物工程公司合成。

反应体系：以β球蛋白（β-Globin）为内对照，PCR反应体系（25μl）：Buffer 2.5μl，25mM/L的MgCl22.0μl，10mM/L的dNTPs 0.5μl，20μM/L的GSTM1引物各0.3μl，内对照引物各0.2μl，DNA模板200ng（2μl），Taq酶1.5U（0.3μl），补双蒸水至25μl。

反应条件为：开始94℃预变性5min，进入热循环94℃50s、59℃退火50s、72℃50s，共35个循环，最后72℃延伸10min。

取10μl PCR产物于1.8%琼脂糖凝胶水平电泳30min（电压125V），0.5μg/ml的EB染色，ZF型紫外分析仪上观察结果。

1.2.4 统计学方法 计数资料使用χ2检验。用Logistic回归法筛选疾病预后的有关因素，检验水准设为a＝0.10，其余以P＜0.05为统计学有意义。统计学分析均使用SPSS13.0软件。

2 结果

2.1 多态性结果扩增产物如果有215bp和268bp两条带，为GSTM1基因功能型，如果仅有一条268bp条带则为GSTM1基因缺失型。

2.2 GSTM1与肺癌的关系 GSTM1基因缺失在肺癌组和对照组中的频率分别为67.0%（61/91）和50.7%（70/138），两组差异无统计学意义（P＞0.05），见附表2。

2.3 吸烟、GSTM1与肺癌关系 将病例和对照分为吸烟和不吸烟两组，在吸烟组中，GSTM1基因多态性在病例组和对照组间的差异没有统计学意义；而在不吸烟组中，GSTM1基因多态性在病例组和对照组间的差异有统计学意义，见附表3。

2.4 肺癌类型、GSTM1与肺癌关系 将病例组分为腺癌和鳞癌两类，发现肺癌病理组织学类型与GSTM1基因多态性差异无统计学意义，见附表4。

2.5 运用Logistic回归评价各影响因素与肺癌的关系 在91例原发性肺癌患者中，以文化程度、吸烟、吸烟量、戒烟、开始吸烟时间、家内吸烟者、工作环境吸烟者、家庭有无排气扇、家庭有无抽油烟机、食动物油、常吃豆类制品、常吃蔬菜、常吃胡萝卜、常吃水果、常吃肉类、饮酒、饮茶、体育锻炼、有无长期精神压抑、直系亲属癌症史及GSTM1基因多态情况作自变量，以肺癌患病率为因变量，经多变量logistic回归分析，用向前法筛选变量，引入变量的检验水准为a＝0.10。所研究的22个相关因素中，入选模型GSTM1基因多态、吸烟、饮酒、精神调节能力、长期精神压抑、家庭有无抽油烟机、有无直系亲属肺癌史等因素与肺癌发病有关联，其OR值分别为：1.77、2.34、2.67、1.53、1.83、3.27、3.29，是影响肺癌患病率的危险因素。

附表1 GSTM1基因及β-globin基因扩增引物序列

附表2 GSTM1基因缺失与肺癌相对危险性分析

附表3 吸烟状况及GSTM1基因缺失与肺癌的关系

附表4 肺癌病理组织学类型与GSTM1的关系

3 讨论

谷胱苷肽硫转移酶M1（GSTM1）是谷胱苷肽硫转移酶超基因家族中Mu家族的成员之一，GSTMl主要催化谷光苷肽与环氧化物及多环芳烃（苯并芘）的羟基代谢产物等，能解毒代谢产物使其形成亲水性物质而排出体外[4][5]，GSTM1等位基因纯合缺失，该基因型为GSTM1基因缺失型；GSTM1等位基因无缺失或杂合性缺失，该基因型为GSTM1基因功能型。若个体为GSTM1基因缺失型，则其体内没有GSTM1酶的表达。1990年首次报道GSTM1基因缺失与肺癌发生有密切关系后[6]。国内外对此进行了大量研究，其结果不一。在本研究结果中，GSTM1基因缺失率在病例组和对照组的差异无统计学意义。

部分人存在的GSTM1缺失型是造成人群GSTM1基因多态的原因，编码该酶的等位基因纯合缺失可导致体内不能产生有活性的酶蛋白，使得致癌物在体内蓄积，机体的化学解毒能力下降，对癌症的易感性增加[7][8]，尤其增加了吸烟相关性肺癌发生的危险性，并与肺鳞癌的危险性显著增高[9]。Cabral等[10]对基因改变与肺癌易感性关系的研究结论相类似。笔者的研究将吸烟和不吸烟分为病例组和对照组，在吸烟组中，GSTM1基因缺失在两组间的差异没有统计学意义；而在不吸烟组中，GSTM1基因缺失在两组间的差异有统计学意义。杜国波等[11]对川北地区125例肺癌患者和125例非肺癌患者GSTM1基因多态性研究发现，GSTM1基因缺失型与肺癌类型无明确关系。

目前国内外对吸烟、GSTM1、肺癌类型等相关因素与罹患肺癌危险性关系的研究结果也不一致，因此在分析GSTM1基因与肺癌的关系时，应结合其他的环境暴露来进行才能真正揭示其在肺癌发生中的作用。

笔者所研究的22个相关因素中，入选模型GSTM1基因多态、吸烟、饮酒、精神调节能力、长期精神压抑、家庭有无抽油烟机、有无直系亲属肺癌史等因素与肺癌发病有关联，是影响肺癌患病率的危险因素。祝小霞[12]等报道烹调油烟暴露是非吸烟女性肺癌的危险因素，CYP1A1 MspI基因多态性与烹调油烟联合作用可增加肺癌发病的风险，这也说明肺癌本身遗传易感性机制十分复杂，不同种族和地区的环境暴露也是造成不同人群易感性的明显差异的重要原因之一。因此，深入研究GSTM1基因缺失型与环境暴露因素和遗产易感性的交互作用在肺癌发病中的影响，发现并保护易感人群，对降低肺癌发病率具有重要的意义。