RP-HPLC法测定甲硝唑氯化钠注射液中乙二胺四乙酸二钠的含量

江苏省盐城市药品检验所（224002）周会芹 王梅娟

甲硝唑氯化钠注射液中的甲硝唑是硝基咪唑衍生物，对大多数厌氧菌具有强大的抗菌作用，但对需氧菌和兼性厌氧菌无作用。在临床使用时，甲硝唑氯化钠注射液有时出现混浊现象。有研究表明，甲硝唑氯化钠注射液处方中添加乙二胺四乙酸二钠（EDTA）后可显著提高其稳定性，其原理为EDTA与输液中微量的金属离子形成螯合物后，阻止了金属离子对药物自身氧化的催化作用。因此在甲硝唑氯化钠注射液处方中添加一定量的EDTA作为螯合剂，显著改善了输液的配伍稳定性。但如人体大量摄入EDTA时，则会与血液及骨骼中经过的钙形成水溶性螯合物，被排出体外，引起低血钙症或骨钙流失，因此有必要对EDTA的含量进行控制，虽然已有EDTA的检查报道，但方法不能定量检测，为确保用药安全，笔者参照相关文献，建立了甲硝唑氯化钠注射液中EDTA的含量测定方法。

1 仪器与试药

Agilent高效液相色谱仪（美国Agilent公司）Agilent-1200色谱工作站（美国Agilent公司）；BP211D电子天平（德国赛多利斯公司）；Seven Easy pH计（上海精密仪器科学仪器有限公司）。

甲硝唑氯化钠注射液，规格：100mL；甲硝唑100mg与氯化钠0.8g，江苏长江药业有限公司，批号：120107、120527、121002；乙腈为色谱纯（美国Tedia公司），乙二胺四乙酸二钠磷酸、10%四丁基氢氧化铵溶液及其他试剂均为分析纯。

2 色谱条件及系统适用性试验

附图 对照品、样品、阴性对照图谱

附表1 EDTA线性关系

附表2 稳定性试验

色谱柱：Agilent C18（150mm×4.6mm，5µm），流动相为乙腈∶缓冲液（10%四丁基氢氧化铵溶液6mL，加水稀释至200mL，以磷酸调节pH值为6.5）∶水（20∶20∶60），检测波长为254nm，流速为1.0mL/min，柱温30℃，进样量为20µL。

3 溶液的制备

3.1 对照品溶液 精密称取EDTA适量，加水使溶解并定量稀释成0.5g/L的EDTA溶液，精密吸取5mL置50mL量瓶中，加1%硫酸铜溶液10mL，加水稀释至刻度，摇匀，以0.45µm的微孔滤膜滤过，即得。

3.2 供试品溶液 精密量取甲硝唑氯化钠注射液适量（相当于EDTA 2.5mg），置50mL量瓶中，加水适量使溶解，加1%硫酸铜溶液10mL，加水稀释至刻度，摇匀，以0.45µm的微孔滤膜滤过，即得。

3.3 空白溶液 精密称取不含EDTA的空白制剂适量（相当于EDTA 2.5mg），置50mL量瓶中，加水适量使溶解，加1%硫酸铜溶液10mL，加水稀释至刻度，摇匀，以0.45µm的微孔滤膜滤过，即得。

附表3 EDTA重复性试验

附表4 EDTA加样回收率试验结果

4 方法与结果

4.1 系统适用性试验 精密称取EDTA空白溶液、供试品溶液及对照品溶液各20µL，分别记录色谱图，结果表明EDTA峰的理论塔板数为2000左右，甲硝唑与EDTA的分离度良好，见附图。

4.2 线性关系考察 精密吸取0.5g/L的EDTA溶液0.5，1.0，2.0，4.0，8.0，16.0mL分别置50mL容量瓶中，加1%硫酸铜溶液10mL，用水稀释至刻度，摇匀，0.45µm的微孔滤膜滤过并精密量取续滤液20µL，注入液相色谱仪，记录色谱图以EDTA进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线得回归方程：Y＝53653.7645X－1486.1658，r＝0.9998，结果表明：EDTA进样量在0.1～2.0µg范围内有良好的线性关系，见附表1。

4.3 稳定性试验 取同一批号（120107）的供试品溶液，精密吸取20µL，每间隔一定时间进样，测定，以峰面积考察。EDTA的RSD分别为0.93%，结果表明，供试品溶液在24h内基本稳定，说明本方法有良好的稳定性，见附表2。

4.4 重复性试验 取同一批号的甲硝唑氯化钠注射液（批号：120107）6份，按含量测定方法项下平行试验，测定其含量，结果EDTA的平均含量别为4.20，重复性试验RSD分别为1.46%，见附表3。

4.5 加样回收率试验 称取3批已知含量的样品，每批做三份（批号：120107、120527、121002），精密称定，分别精密加入对照品适量，按上述方法制备供试品溶液，测定其含量，计算回收率。结果显示，EDTA平均回收率为98.11%；RSD为1.06%，见附表4。

4.6 样品测定 精密量取本品适量（相当于EDTA2.5mg），置50mL量瓶中，加水适量，加1%的硫酸铜溶液10mL，加水稀释至刻度，摇匀，以0.45µm的微孔滤膜滤过，精密量取20µL，注入液相色谱仪，记录色谱图，另精密称取EDTA25mg，置50mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取5mL置50mL量瓶中，加1%的硫酸铜溶液10mL，加水稀释至刻度，摇匀，以0.45µm的微孔滤膜滤过，同法测定。按外标法以峰面积计算，即得。

4.7 检测下限考察 取EDTA溶液（0.51mg/mL）1mL置10mL容量瓶中制成混合液[1]，取混合液依次稀释至1000倍时，信噪比（S/N）约为10，检测限浓度分别约为0.51µg/mL。

5 讨论

由于EDTA易与金属离子络合，在色谱柱中会与色谱柱不锈钢表面发生络合，导致其相应值变低、峰形严重拖尾。本法采用硫酸铜溶液，使EDTA和铜离子形成比较稳定的络合物，避免发生作用。研究表明，1%的硫酸铜溶液的用量为10mL时，EDTA的峰形较好，故本法采用1%的硫酸铜溶液的用量为10mL作为反应浓度。在加硫酸铜溶液进行反应时溶液会发生混浊，因此在反应完加到刻度后，用0.45µm的微孔滤膜过滤，防止堵塞和污染色谱柱，且可降低对EDTA测定的干扰作用。故采用本法测定甲硝唑氯化钠注射液中EDTA的含量，分离度好。