模拟失重大鼠胰腺组织HSP70表达的变化

刘飞 周金莲 段育忠 张诗琳 杨建武 杨鹤鸣 李成林 崔彦

·论著·

模拟失重大鼠胰腺组织HSP70表达的变化

刘飞 周金莲 段育忠 张诗琳 杨建武 杨鹤鸣 李成林 崔彦

目的研究模拟失重环境下大鼠胰腺组织HSP70表达的变化。方法健康雄性Wistar大鼠64只，采用尾悬吊法建立模拟失重动物模型。按完全随机法分为悬尾6、12 h及1、2、3、5、7 d组和未悬尾对照组。应用免疫组化法、蛋白质印迹法和RT-PCR法检测各组大鼠胰腺组织HSP70蛋白和mRNA的表达。结果免疫组化染色显示，对照组大鼠胰腺组织无HSP70蛋白表达，悬尾组大鼠胰腺组织均有HSP70蛋白表达，尤其是胰岛细胞的胞质和胞核在早期即深染。蛋白质印迹法结果显示，悬尾6、12 h及1、2 d组大鼠胰腺组织HSP70蛋白持续高表达，分别为0.921±0.078、0.862±0.048、0.838±0.063、0.807±0.071，较对照组的0.693±0.055显著增加(P<0.05)；3、5、7 d组的HSP70蛋白表达恢复到对照组水平。HSP70 mRNA表达在6 h组即明显增加至0.881±0.013，然后逐渐回落，3 d组降至0.694±0.027，5 d组出现回升，达0.836±0.014，7 d组又回落至0.674±0.013。结论模拟失重使大鼠胰腺组织中HSP70蛋白和mRNA表达发生明显变化，早期过表达，后期恢复正常水平。

失重模拟； 胰腺； HSP70热休克蛋白质类； 大鼠

随着宇宙探测活动的日益频繁和空间技术的迅速发展，对于失重状态下航天员身体各器官系统变化的研究显得愈加重要。胰腺作为人体最大的消化和内分泌器官之一，了解失重对其功能及结构影响的意义十分重大。然而国内外在这方面的研究报道相对较少[1-3]。本研究检测模拟失重环境下大鼠胰腺组织中诱导型热休克蛋白70(heat shock protein，HSP70)的表达，探讨胰腺组织对失重的应激反应特点，为航天员训练和飞行的医疗保障提供参考依据。

材料与方法

一、实验动物与分组

清洁级健康成年雄性Wistar大鼠64只，平均体重(300±50) g，由中国农业大学动物实验研究所提供。饲养条件为人工控温(22±2)℃，每12 h昼夜循环，自由饮水采食。经适应性饲养1周后进行实验。

采用尾吊法建立模拟失重模型[4]，即将大鼠尾部吊起，头体下悬，前肢着地，后肢完全解除负荷，与地面成30°，可以自由活动。按数字表法随机分为悬尾6、12 h及1、2、3、5、7 d组，并以未悬尾作为对照组，每组8只。实验结束时，腹腔注射水合氯醛(300 mg/kg体重)麻醉大鼠，无菌操作，经腹正中线剖腹，取胰尾组织保存于-80°冰箱中，胰头组织浸于4%多聚甲醛(pH7.4)固定，常规石蜡包埋。

二、大鼠胰腺组织HSP70蛋白检测

取各组石蜡包埋的胰腺组织，常规切片，采用免疫组化法检测胰腺组织HSP70蛋白表达。抗HSP70单抗购自美国Novus Biologicals，Biolab，生物素标记的羊抗鼠IgG及辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素购自美国Zymed公司，最后 DAB显色，复染，脱水，透明，封片。镜下见胞核和(或)胞质中有明显的棕黄色颗粒为HSP70表达阳性。

另取冻存的新鲜胰腺组织，在液氮预冷的研钵中研碎，加入组织裂解液(含蛋白酶抑制剂)置冰上20 min，低温下12 000 r/min离心15 min，取上清。Bradford法定量蛋白后常规行蛋白质印迹法检测HSP70蛋白表达，最后ECL发光，暗室内显影。以 GAPDH作为内参。应用AlphaImager 2200 软件分析条带的吸光值，以HSP70条带与GAPDH条带的吸光值比值表示蛋白表达量。

三、大鼠胰腺组织HSP70 mRNA检测

根据Genebank设计引物序列。HSP70上游引物5′-ATCATCTCAACGAGCCACAG-3′，下游引物5′-ACAGGTCCGAGCACAGCT-3′，扩增片段415 bp；GAPDH上游引物5′-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′，下游引物5′-GGGTGGTCCAGGGTTTCTTA-3′，扩增片段186 bp。 取冻存胰腺组织放入研磨器中研磨，按100 mg粉末加入1 ml Trizol提取总RNA，采用RT-PCR法检测HSP70mRNA的表达。PCR条件：94℃ 5 min，95℃ 10 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，39个循环，72℃延伸10 min。以GAPDH为内参。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳分离，用电泳凝胶图像分析系统进行灰度扫描，以目的条带与GAPDH条带的灰度比值表示HSP70 mRNA的表达量。

四、统计学分析

结 果

一、实验动物一般情况

本实验过程顺利，无大鼠死亡。悬吊第1天，大鼠烦躁不安，精神萎靡，排泄物增多，饮食较对照组减少，2 d以后各组大鼠逐渐恢复平静，饮食、饮水逐渐正常。

二、胰腺组织HSP70蛋白表达

免疫组化结果显示，对照组大鼠腺泡细胞和胰岛细胞均未见着色(图1a)。悬尾各组大鼠胰腺组织均有HSP70阳性表达，表现为胞质和胞核呈棕褐色。在悬吊6 h～2 d期间，腺泡细胞HSP70蛋白表达量随悬吊时间延长而增加，表现为胞质染色逐渐加深，胰岛细胞在模拟失重早期即过表达，表现为胞质深染(图1b～d)；悬吊3～5 d组大鼠胰腺组织的HSP70蛋白表达逐渐下降，染色逐渐变浅。

蛋白质印迹法结果显示，各组大鼠胰腺组织均有HSP70蛋白表达(图2)。悬吊6 h组HSP70蛋白表达水平最高，并持续高表达达2 d，均较对照组显著升高(P值均<0.05)；悬吊3 d后HSP70蛋白表达下降，3、5、7 d时的HSP70表达水平与对照组比较差异无统计学意义(表1)。

三、胰腺组织HSP70 mRNA的表达

各组大鼠胰腺组织中均有HSP70 mRNA表达(图3)，表现为早期上升后期回落的特征。模拟失重6 h大鼠胰腺组织HSP70 mRNA表达水平即升高，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。12 h及1、2、3 d组的HSP70 mRNA表达逐渐回落，但5 d组出现回升，7 d组又降至正常水平(表1)。

图1对照组(a)及尾悬吊12 h(b)、1d(c)、2 d(d)大鼠胰腺组织的HSP70表达(免疫组化 ×400)

1：对照组；2～3：悬尾6、12 h组；4～8：悬尾1、2、3、5、7 d组

组别只数mRNA表达量蛋白表达量对照组80．675±0．0160．693±0．055悬尾6h组80．881±0．013a0．921±0．078a 12h组80．874±0．014a0．862±0．048a 1d组80．865±0．014a0．838±0．063a 2d组80．837±0．012a0．807±0．071a 3d组80．694±0．0270．691±0．059 5d组80．836±0．014a0．633±0．062 7d组80．674±0．0130．604±0．069

注：与对照组比较，aP<0.05

1：对照组；2～3：悬尾6、12 h组；4～8：悬尾1、2、3、5、7 d组

讨 论

HSP70是进化上高度保守的一种特殊应激蛋白质，具有分子伴侣作用。正常情况下，HSP70在细胞质较低表达。多种不良刺激，如热刺激、缺血、缺氧、过氧化、低血糖、紫外线、γ射线、外伤、病毒和细菌感染以及某些化学物质(乙醇、亚砷酸钠、砒霜)中毒[5-7]等均可诱导细胞胞核中HSP70蛋白在几分钟或几十分钟内迅速增加，聚集核内并包围核仁。一但刺激消除或对刺激适应后，组织细胞便进入应激恢复期，胞核中HSP70表达减少甚至中止，但胞质中仍有低水平表达。HSP70在应激过程中的转录、表达和调控机制尚未完全清楚[6-7]。

相关研究表明，失重状态及其一系列连锁反应亦属于对机体的特殊刺激[8-9]。失重作为一种特殊的应激原，同样可能引起HSP70表达水平发生变化。Ohnishi等[9]报道，搭乘NASA航天飞行器的金鱼对微重力及空间辐射产生分子水平的应激诱导反应，多个脏器的HSP72水平明显升高。刘春等[10]在大鼠心肌、血管组织的模拟失重实验研究中发现，失重本身并不诱导大鼠心肌组织表达HSP70，但可诱导大鼠脑血管HSP70表达增加，而后肢血管的HSP70表达则下降。Ding等[11]进行为期2个月的模拟失重研究，发现模拟失重环境中大鼠肾脏HSP70过表达，对抗训练能减少肾脏细胞凋亡，降低肾组织HSP70表达，进而减轻失重造成的肾脏损伤。崔彦等[12]研究发现，HSP70蛋白和mRNA在模拟失重大鼠肝组织中的表达表现为应激早期升高、后期下降的特征。而失重情况下胰腺组织中HSP70表达的相关研究尚未见文献报道。

本研究结果显示，尾悬吊模拟失重导致实验大鼠胰腺组织尤其胰岛细胞中HSP70蛋白表达发生明显变化，胰岛细胞核在模拟失重早期即出现深染，说明失重对胰岛细胞的结构和功能造成一定影响，这与文献报道以及笔者前期研究发现失重大鼠血清胰岛素短期内升高、血糖波动明显的特点相符[13-16]。腺泡细胞的染色变化不及胰岛细胞，亦与笔者前期研究发现血清淀粉酶和脂肪酶在模拟失重过程中仅呈一过性升高的特点有一定类同性[16]。显然，HSP70在胰腺的失重应激反应过程中发挥了重要作用，但具体机制和胰腺组织中各种类型细胞对模拟失重的各自反应特点，尤其失重环境下胰岛β细胞的功能变化和胰岛素的代谢特性及机制尚需做深入的研究。

本研究结果还表明，大鼠胰腺组织中HSP70蛋白和mRNA的表达水平在尾悬吊早期即同步显著上升，提示模拟失重是一种能诱导胰腺组织细胞表达HSP70的特殊而典型的应激原。HSP70表达于模拟失重6 h形成高峰之后逐渐回落，其中HSP70 mRNA下降速度较快，幅度较大，而HSP70蛋白表达水平回落较慢，接近正常范围时趋于稳定。我们认为，这一方面符合HSP70基因激活转录优先并指令蛋白合成的规律，同时有可能存在HSP70 mRNA上下游基因信号调控的特殊机制。HSP70早期急剧升高、后期逐渐回落的现象表明其不但具有双刃剑样作用，还具有交叉耐受特性及记忆功能，其表达过程及水平与组织细胞应激损伤和自身保护机制密切相关，同时HSP70形成的应激耐力无特异性[6-7,17]。根据文献和本研究结果推测，HSP70在胰腺的失重应激损伤与失重应激耐受或适应过程中可能发挥重要作用，失重及非失重应激原诱导HSP70表达均应能提高失重应激耐力，此机制的诠释在失重训练和航天飞行中可能有重要意义。

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(本文编辑：吕芳萍)

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HSP70expressioninpancreasofratsundertheconditionofsimulatedweightlessness

LIUFei,ZHOUJin-lian,DUANYu-zhong,ZHANGShi-lin,YANGJian-wu,YANGHe-ming,LICheng-lin,CUIYan.

DepartmentofGeneralSurgery,The306HospitalofPLA,Beijing100101,China

CUIYan,Email：dryancui@yahoo.com.cn

ObjectiveTo investigate Hsp70 expression features of rat′s pancreas under the condition of simulated weightlessness.MethodsTail-suspension method was used to simulate the weightlessness animal model. Sixty four adult male Wistar rats were randomly divided into 8 experimental groups (n=8)：suspended for 6 h, 12 h, 1 d, 2 d, 3 d, 5 d, 7 d and control group. Hsp70 protein and mRNA in rat′s pancreas were detected by using immunohistochemical assay, Western blot and RT-PCR techniques.ResultsThe immunohistochemistry assay showed that Hsp70 protein was expressed in rats with tail-suspension, in particular the nuclei and cytoplasm of pancreatic islet cells were deeply stained in the early phase of suspension, but was not expressed in rats without tail-suspension. The expressions of Hsp70 protein were 0.881±0.013, 0.874±0.014, 0.865±0.014, 0.837±0.012 in 6 h, 12 h, 1 d, 2 d groups, which were significantly higher than those in control group (0.921±0.078,P<0.05)，and 0.862±0.042, 0.838±0.063, 0.807±0.071 in 3 d,5 d,7 d groups, which returned to the level of control group. The expressions of Hsp70 mRNA significantly increased at 6 h, and then gradually decreased, at 3 d they reached the lowest point (0.694±0.027), and they began to increase to 0.836±0.014 at 5 d and decrease to 0.674±0.013 at 7 d.ConclusionsThe simulated weightlessness has remarkable effect on the expressions of Hsp70 protein and mRNA in rat′s pancreas, and the expressions are up-regulated in the early phase and returns to normal level in the late phase.

Weightlessness simulated； Pancreas； HSP70 heat-shock proteins； Rat

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.01.009

全军医学科研“十一五”后勤科研攻关项目(08G058)；全军医学科研“十二五”重点项目(BWS11J051)

100101 北京，解放军第306医院普通外科(刘飞、段育忠、张诗琳、杨建武、杨鹤鸣、李成林、崔彦)，病理科(周金莲)

崔彦，Email:dryancui@yahoo.com.cn

2012-09-26)