Delta-like 4在胰腺癌中的表达及其意义

张伟杰 徐桂芳 周志华 田志强 邹晓平

·论著·

Delta-like 4在胰腺癌中的表达及其意义

张伟杰 徐桂芳 周志华 田志强 邹晓平

目的检测Delta-like 4(DLL4)在胰腺癌中的表达，探讨其临床意义。方法采用免疫组化法检测60例胰腺癌组织中DLL4的表达，行血管内皮特异性标志物CD34免疫染色，计算微血管密度(MVD)；分析它们的相关性及其与胰腺癌临床病理特征、患者预后的关系。结果DLL4在胰腺癌组织中的表达明显高于正常胰腺组织(68.3%比20.0%,χ2=14.239,P<0.01)，其高表达与胰腺癌的肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移及累及范围密切相关，与肿瘤大小、部位、病理分型无关。胰腺癌组织MVD明显高于正常胰腺组织(34.9±13.2比18.9±2.2,t=3.570,P<0.01)，其与肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移及累及范围密切相关，与肿瘤大小、部位及病理分型无关。DLL4阳性表达与预后密切相关。经Cox模型分析，TNM分期、DLL4阳性表达是胰腺癌患者预后不良的独立危险因素。结论DLL4的高表达在胰腺癌转移、浸润中起重要作用。肿瘤DLL4表达和TNM分期对评估胰腺癌患者的预后有一定价值。

胰腺肿瘤； Delta-like 4； 微血管密度； 免疫组织化学； 预后

Delta-like 4(DLL4)是哺乳动物中一个主要与Notch1相互作用的Notch配体[1]，可以活化Notch信号，在肿瘤血管的新生、发育和成熟过程中起主要作用[2]。恶性胶质瘤及前列腺癌的肿瘤细胞过表达DLL4，并促进肿瘤的生长[3]。本实验检测胰腺癌组织DLL4的表达及其与微血管密度(microvessel density, MVD)的关系，探讨DLL4在判断胰腺癌患者预后中的价值。

材料和方法

一、研究对象

收集南京鼓楼医院2000年10月至2002年8月手术切除的60例胰腺癌标本，其中男42例，女18例，年龄39～72岁，中位年龄63岁。取其中20例肿瘤边缘处的正常胰腺组织作为对照。病理诊断与分类依据国际抗癌联合会的TNM分类。

二、DLL4蛋白及MVD检测

采用免疫组化染色法检测组织DLL4的表达和MVD。兔抗人DLL4多抗购自Abcam公司，工作浓度1∶10；兔抗人CD34多抗购自福州迈新公司，工作浓度1∶100；链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶超敏试剂盒和二氨联苯胺酶底物显色试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司，按试剂盒说明书操作。用PBS替代一抗作空白对照。

每张切片由两位病理医师盲法分别读片及评分。胞质中出现棕黄色颗粒为DLL4阳性染色。每张切片选取5个400倍视野，每个视野计数100个肿瘤细胞，计算阳性细胞数百分比。阳性细胞数<10%为阴性(-)，10%～25%为弱阳性(+)，26%～50%为中度阳性(++)，>50%为强阳性(+++)。CD34表达于血管内皮细胞膜，每一个染成棕黄色的，可与周围血管、肿瘤细胞及其他结缔组织区分开来的明显微小血管腔或含3个以上内皮细胞的内皮细胞簇，不论管腔和红细胞出现与否，均作为一个单一的可计数的微血管。管腔面积>8个红细胞直径、带有较厚肌层的微血管均不计数[4]。先于低倍镜下确定3个血管着色最密集区域，然后在200倍视野下计数微血管的数目，取均值作为MVD。

三、统计学处理

用log-rank检验，影响预后因素采用多因素Cox回归分析。P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、胰腺癌组织DLL4表达及其与肿瘤临床病理特征的关系

胰腺癌组织DLL4的阳性表达率为68.3%(41/60)，癌旁正常胰腺组织表达率为20.0%(4/20，图1)，两者差异具有统计学意义(χ2=14.239，P<0.01)。胰腺癌组织DLL4表达与肿瘤分化程度、T分期、TNM分期、淋巴结转移相关，而与患者年龄、性别及肿瘤部位、大小、病理分型无关(表1)。

图1 胰腺癌(a)和癌旁组织(b)的DLL4表达(×400)

二、胰腺癌组织MVD及其与肿瘤临床病理特征的关系

胰腺癌组织的MVD为34.9±13.2，癌旁正常胰腺组织为18.9±2.2(图2)，两者差异具有统计学意义(t=3.570，P<0.01)。胰腺癌组织MVD与肿瘤分化程度、T分期、TNM分期、淋巴结转移相关，与患者年龄、性别及肿瘤部位、大小、病理分型无关(表1)。

图2 胰腺癌(a)和癌旁组织(b)的CD34表达(×400)

三、胰腺癌组织DLL4表达与MVD的关系

胰腺癌组织DLL4表达与MVD呈显著正相关(r=0.669，P<0.05)。

表1 胰腺癌组织DLL4表达、MVD与临床病理特征的关系

四、胰腺癌组织DLL4表达与患者预后的关系

60例患者随访截止日期为2004年1月。期间失访3例，病死50例。 57例患者中位生存时间为301 d，1年生存率为30.5%(图3a)。DLL4阴性患者的中位生存时间为569.5 d，1年生存率为66.7%；DLL4阳性患者中位生存时间218 d，1年生存率为20.5%(图3b)，DLL4阴性胰腺癌患者的预后明显好于DLL4阳性组患者(P<0.01)。

图3 胰腺癌组织DLL4表达与患者生存关系

运用Cox模型对可能影响患者预后的因素进行分析，结果表明，DLL4表达量、TNM分期为影响胰腺癌患者预后的独立因素(表 2)。

表2 胰腺癌预后相关因素的多因素分析

讨 论

DLL4是Notch信号通路中的一个重要配体，与肿瘤血管生成有关。哺乳动物细胞中Notch信号通路包含了5种跨膜Notch配体(Jagged1、Jagged2、DLL1、DLL3和DLL4)和4种Notch受体(Notch1～4)[1]。血管内皮细胞表达Notch1和Notch4受体及jagged1、DLL1和DLL4配体。肿瘤血管和肿瘤细胞也高表达DLL4，可以活化Notch信号[5-6]。本研究结果显示，胰腺癌组织高表达DLL4，且与肿瘤组织MVD呈显著正相关，与胰腺癌的浸润深度呈正相关，提示DLL4的过表达与胰腺癌的侵袭和转移能力密切相关。

抑制肿瘤组织中DLL4的过度表达将使肿瘤组织生成大量无功能的新生血管，造成肿瘤组织血供不足，最终导致肿瘤生长受到抑制[7-9]。Li等[10]报道，抗DLL4抗体可以特异性阻断Notch信号通路，抑制肿瘤生长，并减少肿瘤启动细胞的发生率。新近研究发现，特异性地阻断DLL4信号通路能够抑制胰腺癌肿瘤血管生成，进而抑制肿瘤生长[11]。

MVD是衡量血管生成的定量指标。MVD与多种肿瘤生长转移相关。Ikeda等[12]通过单因素和多因素研究认为，MVD可作为影响胰腺癌预后的独立因素。章福彬等[13]认为，MVD与临床病理特征关系密切，且与疾病进展阶段呈正相关。本结果显示，胰腺癌组织MVD明显升高，提示胰腺癌是一种血管丰富的恶性肿瘤。

本研究中，DLL4阳性表达患者的中位生存时间明显短于DLL4阴性患者，与Chen等[14]研究结果相似。

总之，DLL4的表达在胰腺癌的血管生成过程中起着重要作用，与胰腺癌的转移、浸润密切相关，其表达可作为判断胰腺癌预后的一个有意义指标。

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[14] Chen HT, Cai QC, Zheng JM, et al.High Expression of Delta-Like Ligand 4 Predicts Poor Prognosis After Curative Resection for Pancreatic Cancer. Ann Surg Oncol, 2012,19:S464-S474.

(本文编辑：屠振兴)

补充说明

本刊2012(6)期“小型猪不同程度阻塞性慢性胰腺炎模型建立及其CT表现”一文作者单位：宁波大学医学院附属医院影像科(汪建华)；第二军医大学长海医院核医学科(汪建华、左长京、张建、孙高峰、茅娟莉、潘桂霞、彭烨)，放射科(李晓栋)，病理科(郑建明)；复旦大学医学院附属华山医院放射科(冯晓源)。通信作者：冯晓源：Email:cjr.fengxiaoyuan@vip.163.com。基金项目：上海市科委科研基金(10410708800)，中国博士后科学基金(20100480545)，浙江省医药卫生科技计划项目(2012KYB176)，宁波市自然基金(2010A610052)。特此补充，顺致歉意！

ExpressionandroleofDelta-like4inpancreaticcancer

ZHANGWei-jie,XUGui-fang,ZHOUZhi-hua,TIANZhi-qiang,ZOUXiao-ping.

DepartmentofScienceandTechnology,DrumTowerHospital,NanjingUniversityMedicalSchool,Nanjing210008,China

ZOUXiao-ping,Email:zouxiaoping795@hotmail.com

ObjectiveTo investigate the expression of Delta-like 4 (DLL4) in pancreatic cancer and its clinical significance.MethodsThe expression of DLL4 in pancreatic cancer was examined by immunohistochemistry method. The microvessel density (MVD) was calculated after CD34staining specifically for microvessel endothelium; and their correlations and relationship between them and clinicopathological parameters as well as prognosis of pancreatic carcinoma was investigated.ResultsThe expression of DLL4 in pancreatic cancer was significantly higher than that in normal pancreatic tissue (68.3%vs20%,P<0.01). The over-expression of DLL4 in pancreatic cancer was related to degree of differentiation, TNM staging, lymph node metastasis and invasion depth, while not related to the size, location and histological types. The MVD in pancreatic cancer tissues was notably higher than that in normal tissues (34.9±13.2vs18.9±2.2,P<0.01). MVD was correlated to degree of differentiation, lymph node metastasis, but not related to the size, location and histological types. DLL4 expression was closely associated with prognosis．COX model analysis showed that TNM staging and DLL4 expression were independent prognostic factors for pancreatic cancer.ConclusionsThe over-expressions of DLL4 may play an important role in metastasis and invasion of pancreatic cancer. Expression of DLL4 and TNM staging is useful for predicting the prognosis of patients with pancreatic cancer.

Pancreatic neoplasms； Delta-like 4； Microvessel density; Immunohischemistry； Prognosis

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.01.007

南京大学中央高校科研资助项目(021414340038)

210008 南京，南京大学附属鼓楼医院科技处(张伟杰)，消化内科(徐桂芳、邹晓平)；解放军第101医院病理科(周志华)，普外科(田志强)

邹晓平，Email:zouxiaoping795@hotmail.com

2012-04-06)