ARHI基因转染PANC1细胞后对细胞凋亡和自噬相关基因表达谱的影响

杨红 路新卿 李骥 朱永健 丁辉 王健 胡益群 邓卫萍 钱家鸣

·论著·

ARHI基因转染PANC1细胞后对细胞凋亡和自噬相关基因表达谱的影响

杨红 路新卿 李骥 朱永健 丁辉 王健 胡益群 邓卫萍 钱家鸣

目的观察ARHI基因转染PANC1细胞后对细胞凋亡和自噬相关基因mRNA表达谱的影响。方法采用脂质体法将表达ARHI基因的质粒pIRES2-EGFP-ARHI、空质粒pIRES2-EGFP转染胰腺癌PANC1细胞。采用基因芯片RT2ProfilerTMPCR Array行实时定量PCR，分析转染细胞的基因表达谱，包括84个与凋亡和自噬相关基因。结果ARHI基因转染组PANC1细胞有9个基因mRNA表达下调，38个基因mRNA表达上调，37个基因mRNA表达变化无意义。在与凋亡相关的基因中有8个促凋亡基因表达显著上调(>6倍)，主要为TNFR/TRFSR家族基因(TNFSF8、TNFRSF10B、TNFRSF11B、TNFRSF9)、CIDE家族基因(DFFA)、CASP家族基因(CASP10、CASP8)和死亡结构域家族基因(DAPK1)，其中以DAPK1上调尤为明显，达42.83倍；抗凋亡基因中3个基因(CD27、BCL2L10、BIRC4)表达显著上调(>6倍)，3个基因(BCL2、BAD、BAG4)表达轻度上调(>2倍)，1个基因(BCL2L1)表达轻度下调(<-2倍)。在与自噬相关的基因中3个促自噬基因(TNFRSF10B、DAPK1、CASP10)表达显著上调(>6倍)，4个基因(TNFRSF10A、FADD、TP53、TP53BP2)表达轻度上调(>2倍)；3个抑制自噬基因(BCL2、CASP8、FAS)表达轻度上调(>2倍)，1个基因(MCL1)表达轻度下调(<-2倍)。结论ARHI基因显著上调细胞凋亡及自噬重要调控基因Caspase-8 和DAPK1。

胰腺肿瘤； 细胞凋亡； 自噬； 基因表达； ARHI gene

胰腺癌的癌变过程是癌基因突变和抑癌基因失活的累积过程。由于胰腺位于后腹膜，活检取组织不易，故其分子生物学研究还存在很多空白。ARHI基因是胰腺癌抑癌基因。本研究组以往的研究结果显示[1-2]，ARHI蛋白在正常胰腺组织中广泛表达，但在胰腺癌组织中表达下调，ARHI基因可以诱导胰腺癌细胞凋亡和细胞自噬，而细胞凋亡和自噬与胰腺癌的发生、发展密切相关。本研究应用基因芯片高通量检测84个与凋亡和自噬相关基因，探讨ARHI基因促进胰腺癌细胞凋亡、诱导自噬的相关分子通路。

材料与方法

一、胰腺癌细胞株及质粒转染

胰腺癌细胞株PANC1来源于ATCC(American type culture collection)。常规培养并传代。取对数生长期细胞接种于6孔板，待细胞融合度达70%～80%时分为实验组、空质粒组、脂质体组和亲本PANC1细胞对照组(对照组)，每组3个复孔，采用脂质体法(Lipofectamine 2000, Invitrogen公司)分别转染表达ARHI基因的质粒pIRES2-EGFP-ARHI、空质粒pIRES2-EGFP、单加脂质体和常规培养液。转染后2 d，培养液中加入终浓度为900 μg/ml的G418 (Gibco公司)筛选14 d，建立稳定转染的PANC1细胞株，具体步骤见文献[2]。

二、实时定量PCR芯片检测

收集各组细胞，采用Trizol(Gibro 公司)提取细胞总RNA，应用Promerga试剂盒逆转成cDNA。实时定量PCR芯片(RT2ProfilerTMPCR Array)购自美国SABioscience公司，包含84个基因，有TNF/TNFR家族、BCL2/BAG家族、BIR家族、CARD家族、死亡家族、TRAF家族和caspase及相关家族等。PCR反应条件：50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 15 s、60℃ 1 min，循环40次。通过PCR仪自带软件获取Ct值。所有检测均设3个平行管，三平行管的Ct值差距<0.5为有效数据，取其平均Ct值。以β-actin为内参照。依据2-△△Ct公式，以空质粒组为基准计算基因相对表达量。>2倍为轻度上调，>6倍为显著上调；<-2倍为轻度下调，<-6倍为显著下调。

结 果

一、凋亡及自噬相关基因表达谱的变化

与空质粒转染细胞比较，实验组PANC1细胞有9个基因mRNA表达下调，38个基因mRNA表达上调，37个基因mRNA表达变化无意义。上调基因较明显的是TNFSF/TFNRSF家族成员、死亡结构域和死亡效应结构域家族成员、CIDE家族成员。TRAF家族表达改变不显著。在凋亡的决定基因家族中，Caspase家族中凋亡启动基因Caspase 8、Caspase 10明显上调，而BCL-2家族基因表达改变不显著。此外p53和DNA损伤反应相关基因的表达改变亦不显著(表1)。

二、ARHI基因对PANC1细胞凋亡相关基因表达的影响

基因芯片中有58个促凋亡基因和26个抗凋亡基因，其中8个促凋亡基因表达显著上调(>6倍)，主要为TNFR/TRFSR家族基因(TNFSF8、TNFRSF10B、TNFRSF11B、TNFRSF9)、CIDE家族基因(DFFA)、CASP家族基因(CASP10、CASP8)和死亡结构域家族基因(DAPK1)，其中以DAPK1上调尤为明显，达42.83倍；3个抗凋亡基因(CD27、BCL2L10、BIRC4)显著上调(>6倍，图1)，3个基因(BCL2、BAD、BAG4)表达轻度上调(>2倍)，1个基因(BCL2L1)表达轻度下调(<-2倍)。

图1 ARHI基因转染后PANC1细胞与凋亡相关基因的表达

基因表达倍数基因表达倍数基因表达倍数TNFLigand家族CD40LG(TNFSF5)4.66FASLG(TNFSF6)1.87LTA2.62TNF1.65TNFSF102.03CD701.69TNFSF819.74TNF受体家族CD40(TNFRSF5)1.11FAS(TNFRSF6)2.62LTBR1.04TNFRSF10A2.61TNFRSF10B9.27TNFRSF11B6.71TNFRSF1A1.82TNFRSF1BTNFRSF211.39TNFRSF25-1.10CD276.86TNFRSF96.98BCL-1家族BAD2.58BAG11.39BAG31.06BAG42.39BAK1-1.76BAX-1.74BCL22.73BCL2A1-2.61BCL2L1-2.34BCL2L107.42BCL2L11-1.24BCL2L21.14BCLAF14.25BID1.51BIK3.43BNIP12.58BNIP21.82BNIP32.12BNIP3L1.01HRK4.18MCL1-2.06Caspase家族CASP1-1.96CASP1010.15CASP142.34CASP2-1.19CASP3-1.43CASP4-1.16CASP5-3.43CASP6-2.13CASP7-1.45CASP85.91CASP9-1.02IAP家族NAIP1.75BIRC22.93BIRC31.98BIRC418.34BIRC61.16BIRC85.13TRAF家族TRAF2-2.47TRAF3-1.18TRAF4-1.78CARD家族APAF12.34BCL101.73BIRC22.93BIRC31.98NOD11.13CARD63.72CARD83.04CASP1-1.96CASP2-1.19CASP41.16CASP5-3.43CASP9-1.02CRADD1.81NOL31.78PYCARD2.41RIPK21.20死亡区域家族CRADD1.81DAPK142.83FADD2.11FAS2.62TNFRSF10A2.61TNFRSF10B9.27TNFRSF11B6.71TNFRSF1A1.82TNFRSF211.39TNFRSF25-1.10TRADD-1.75死亡效应区域家族CASP85.91CASP1010.15CFLAR3.98FADD2.11CIDE区域家族CIDEA4.32CIDEB4.08DFFA6.13P53和DNA损伤反应ABL1-1.69AKT1-1.89APAF12.34BAD2.58BAX-1.74BCL22.73BCL2L1-2.34BID-1.51CASP3-1.43CASP6-2.31CASP7-1.45CASP9-1.02GADD45A2.62TP534.12TP53BP24.55TP739.62其他BFAR5.61NAIP1.75BRAF1.30CFLAR3.98DFFA6.13IGF1R1.37LTBR1.04TNF1.65CD276.86

三、ARHI基因对PANC1细胞自噬相关基因表达的影响

3个促自噬基因(TNFRSF10B、DAPK1、CASP10)表达显著上调(>6倍)，4个基因(TNFRSF10A、FADD、TP53、TP53BP2)表达轻度上调(>2倍)，2个Caspase基因(CASP3、CASP9)表达略下调；3个抑制自噬基因(BCL2、CASP8、FAS)表达轻度上调(>2倍)，1个基因(MCL1)表达轻度下调(<-2倍)，AKT1、TNF基因表达改变不明显(图2)。

图2 ARHI基因转染后PANC1细胞与自噬相关基因的表达

讨 论

上世纪90年代研究者就提出细胞增殖和凋亡之间的失衡造成了肿瘤的发生和发展。近几年又提出了自噬的概念[3-4]。自噬为凋亡所需，通常先于凋亡进而启动凋亡。自噬可保护细胞免于发生凋亡和坏死，也可以向凋亡转化，共同促进细胞死亡。自噬和细胞凋亡之间存在错综复杂的关系，可以通过不同的信号转导途径发挥作用，也可能它们的上游存在相同的信号通路，但在不同的因素影响下调控着两个程序不同的方向。

文献报道[5-7]细胞凋亡分为外源性途径和内源性途径。内源性途径称为线粒体途径，其主要通过p53、BCL-2家族协助启动凋亡信号。外源性途径称为死亡受体途径，通过死亡功能结构域相关蛋白TRADD和FADD的结合，激活Caspase级联反应从而促进细胞凋亡。本研究结果显示ARHI基因转染细胞后显著上调TNFR/TNFSR家族基因、死亡结构域家族基因和CASP家族基因，对p53和DNA损伤反应基因及BCL-2家族基因的表达无显著影响，提示ARHI基因通过上调TNFR受体促进死亡结构域基因的上调(DAPK1)，进而激活Caspase-8启动Caspase级联反应，从而促进细胞凋亡，即为外源性途径。

DAPK1基因是与细胞骨架相关的钙/钙调素调节的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是p53依赖的细胞转化的关键基因，也是细胞转移的抑制剂。该基因可以激活Caspase8而活化Caspase级联反应，促动细胞凋亡的途径，也可以磷酸化beclin1，减少beclin1和bcl-XL结合，从而诱导自噬反应。因此该基因是凋亡和自噬的关联基因，Caspase-8也是细胞凋亡的重要启动基因。近年来研究显示，Caspase-8在细胞自噬中非常重要[8-9]。Yu等[9]的研究发现，Caspase-8不仅可以调节凋亡，还可以抑制自噬性细胞死亡。Caspase-8抑制剂可通过调节Beclin 1和Atg7来促进自噬，提示caspase-8在细胞凋亡和细胞自噬中可能起到开关的作用。本研究还分析了ARHI基因对自噬相关的17个基因表达谱的影响，结果显示ARHI基因可以显著上调TNFRSF10B等7个基因的表达，其中DAPK1表达上调42.83倍，caspase-8基因表达上调5.91倍，提示ARHI促进细胞凋亡和细胞自噬主要是通过caspase-8和DAPK1来调控两个程序的执行。

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EffectofARHItransfectiononapoptosisandautophagyrelatedgeneexpressionprofileofPANC1cells

YANGHong,LUXin-qing,LIJi,ZHUYong-jian,DINGHui,WANGJian,HUYi-qun,DENGWei-ping,QIANJia-ming.

DepartmentofGastroenterology,PekingUnionHospital,ChineseAcademyofMedicalSciences,PekingUnionMedicalCollege,Beijing100730,China

ObjectiveTo investigate the effect of ARHI transfection on the apoptosis and autophagy related gene expression profile of PANC1 cells.MethodsPlasmids pIRES2-EGFP-ARHI which expressing ARHI and empty plasmid pIRES2-EGFP were transfected into PANC1 cells. Expression profile, including 84 apoptosis and autophagy related genes was detected by using quantitative real-time PCR based RT2Profiler TM PCR Array.ResultsIn PANC1 cells transfected with pIRES2-EGFP-ARHI, the expression of mRNA of 9 genes were down-regulated, and 38 were up-regulated, while 37 were not significantly changed. Among the apoptosis related genes, 8 pro-apoptotic genes were significantly up-regulated (>6 folds), and them mainly consisted TNFR/TRFSR family (TNFSF8, TNFRSF10B, TNFRSF11B, TNFRSF9), CIDE family (DFFA), CASP family (CASP10, CASP8), death domain gene family (DAPK1), and the increase of DAPK1 was the most significant (42.83 folds). Three anti-apoptotic genes (CD27, BCL2L10, BIRC4) were significantly up-regulated (>6 folds), and 3 genes (BCL2, BAD, BAG) were slightly up-regulated (>2 folds), 1 gene (BCL2L1) was slightly down-regulated (>2 folds). Among the autophagy related genes, 3 pro-autophagy genes were significantly up-regulated (>6 folds), 4 genes (TNFRSF10A, FADD, TP53, TP53BP2) were slightly up-regulated (>2 folds); 3 anti-autophagy genes (BCL2, CASP8, FAS) were slightly up-regulated (>2 folds), 1 gene (MCL1) was slightly down-regulated (>2 folds).ConclusionsARHI significantly up-regulates autophagy-related important regulatory genes Caspse8 and DAPK1.

Pancreatic neoplasms; Apoptosis; Autophagy; Gene expression; ARHI gene

2013-07-30)

(本文编辑：屠振兴)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.06.002

国家自然科学基金(81072055)；高等学校博士点专项科研基金(20101106120059)

100730 北京，中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院消化科

钱家鸣，Email：qjiaming1957@aliyun.com