IFN－γ基因启动子甲基化与慢加急性肝功能衰竭的相关性研究

李凤彩，李月凯

慢加急性肝功能衰竭是慢性肝病基础上出现的以黄疸急剧加深、凝血功能障碍为特征的肝功能失代偿［1］。IFN－γ是一个重要的免疫反应调控因子，主要由活化的Th1细胞和NK细胞产生。最近研究表明慢加急性肝功能衰竭患者IFN－γ水平升高，IFN－γ可引起肝脏炎症，参与慢加急性肝功能衰竭的发病过程［2］。

甲基化是表达遗传的一种重要机制，是指在DNA甲基转移酶(DNMTs)的介导下，以5－腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体，将胞嘧啶加上一个甲基变为5－甲基胞嘧啶的一种化学修饰过程，可导致基因的表达异常但DNA序列不发生改变［3］，异常甲基化会导致很多疾病的发生。本研究通过测定慢加急性肝功能衰竭患者的IFN－γ基因启动子甲基化状态，探讨IFN－γ基因启动子甲基化与慢加急性肝功能衰竭病情严重指标的关系，为慢加急性肝功能衰竭的发病及预后提供新的思路。

1 资料与方法

1．1 研究对象 慢加急性肝功能衰竭患者20例。其中男17例，女3例;平均年龄(45.9±11.3)岁。诊断符合2006年《肝衰竭诊疗指南》。排除标准:①急性妊娠脂肪肝;②药物性肝炎，酒精性肝炎(男性＞40g/d至少5年;女性＞20g/d至少5年);③怀疑免疫性肝病，肝豆状核变性(Wilson病)等代谢性肝病;④移植术后再感染乙肝导致重型肝炎者;⑤确有原发性肝癌病史;⑥有肝炎以外严重疾病史，包括严重的心脏、肺、肾脏、消化、神经、精神疾病、免疫调节性疾病、代谢性疾病或恶性肿瘤等。

1．2 方法 甲基化特异性PCR(MSP)反应:取新鲜外周静脉血5 ml，肝素抗凝(25 U/ml)，密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PMBc)，按照德国QIAGEN公司的DNA提取试剂盒步骤提取DNA，按照上海杰美公司的DNA甲基化修饰试剂盒步骤进行DNA转化，运用MSP扩增，根据Methprimer软件设计引物，序列如下:M引物:5’－AAGAGTTAATATTTTATTAGGGCGA －3’(上游引物)，5’－TAAACTCCTTAAATCCTTTAACGAT －3’(下游引物)，U引物:5’－TGAAGAGTTAATATTTTATTA GGGTGA－3’(上游引物)，5’－TAAACTCCTTAAA TCCTTTAACAAT－3’(下游引物)。引物由上海生物工程公司合成。PCR反应条件:预变性95℃ 3 min，95℃变性45 s，52℃退火1 min，72℃引物延伸45 s，共运行35个循环，最后72℃延伸10 min，4℃保存。取8μl PCR扩增产物加样后，进行电泳，条件为120 V，35 min。电泳结束后，在紫外线下观察结果并用凝胶电泳图像分析系统分析结果。

1．3 统计学分析 采用SPSS13.0软件包进行，结果用均数±标准差±s)表示，组间显著性分析采用两组独立样本资料的χ2检验，P＜0.05为具有统计学差异。

2 结果

2．1 IFN－γ基因启动子的甲基化状态 在研究中，笔者用甲基化特异性PCR法(MSP)测定了慢加急性肝功能衰竭患者的甲基化程度，结果显示:20例慢加急性肝功能衰竭患者，IFN－γ甲基化者12例，非甲基化者为8例。

2．2 IFN－γ基因启动子甲基化与病情严重指标的关系 慢加急性肝功能衰竭的诊断需要满足血清TBIL＞170μmol/L或每天上升速度＞17.1μmol/L，血浆凝血酶原活动度(PTA)＜40%。终末期肝病模型(MELD)评分系统最早是由于决定肝脏移植器官分配的优先权的需要而提出的，是判断肝衰竭患者预后的评价体系。该系统是利用血清胆红素(TBIL)、血肌酐(Cr)、凝血酶原时间的国际标准化比值(INR)及原发病因作为参数进行量化而得出分值。MELD评分系统对肝衰竭患者的预后和生存率有良好的预测价值。本研究将TBIL、PTA、MELD评分作为评价ACLF患者病情严重程度的指标，分析两组间TBIL、PTA、MELD评分，测得IFN－γ甲基化组TBIL水平明显低于非甲基化组(P＜0.01)，见图1。并测得IFN－γ甲基化组与非甲基化组比较PTA水平无统计学差异(P＞0.05)，见图2。再者，甲基化组MELD水平明显低于非甲基化组(P ＜0.01)，见图3。

图1 两组TBIL水平比较

图2 两组PTA水平比较

图3 两组MELD评分比较

3 讨论

本研究所测得慢加急性肝功能衰竭患者的IFN－γ甲基化程度不同，而且不同的IFN－γ甲基化伴有不同的慢加急性肝功能衰竭病情严重程度指标TBIL水平、MELD评分的不同。

前人研究表明IFN－γ参与慢加急性肝功能衰竭的发病。孙颖等［3］曾报道，慢加急性肝功能衰竭患者的肝脏组织的IFN－γ水平明显升高。Ohta等［4］报道，在重型肝炎的发病机制中，抗原特异性Thl分泌的IFN－γ起重要作用。姜荣龙等［5］报道，在慢性肝炎患者的外周血中，Th2细胞占大多数，Th1细胞占少数，但随着肝脏炎症活动的加剧，Th1细胞比例则明显增加。当Th1细胞亚群占优势时，其分泌的细胞因子IFN－γ可通过直接或间接的作用增强NK细胞、巨噬细胞活性，特别是CD8+细胞活性，促进细胞免疫反应，加重肝脏的炎症损伤［6］。

Melvin等［7］分析了T细胞系 IFN－γ基因启动子区甲基化状态和其表达的关系后发现，IFN－γ基因启动子甲基化程度高时，IFN－γ基因低表达，反之，IFN－γ基因启动子甲基化程度低时，IFN－γ基因高表达，即IFN－γ基因表达水平和甲基化程度之间存在明显负相关。Yano等［8］研究了Th1和Th2细胞的IFN－γ基因启动子的甲基化状态后也得出了相似的结论，Th1的基因启动子是低甲基化的，Th1细胞可产生IFN－γ，而Th2的基因启动子是高甲基化的，Th2细胞不可产生IFN－γ，为了进一步证实甲基化对于基因转录的调控作用，Yano用5’－氮胞苷处理Th2细胞，以抑制组蛋白去乙酰化酶招募到基因启动子区而抑制甲基化形成，从而导致Th2细胞IFN－γ基因启动子去甲基化，结果发现处理后的Th2细胞能够分泌IFN－γ。

综上所述，IFN－γ启动子甲基化通过影响IFN－γ水平参与慢加急性肝功能衰竭的发病并影响其严重程度。

［1］中华医学会感染病分会肝衰竭及人工肝学组，中华医学会肝病分会重型肝病与人工肝学组．肝衰竭诊疗指南［J］．中华肝脏病杂志，2006，14(9):643 －646．

［2］孙 颖，李保森，徐东平，等．肝内IFN－γ及其分泌细胞在乙型慢加急性肝衰竭发病机制中的作用［J］．传染病信息，2008，21(4):227－230．

［3］Wolffe AP．Epigenetics:regulation through repression［J］．Science，1999，286(4):481 －486．

［4］Ohta A，Sekimoto M，Sato M，et al．Indispensable role of TNF － alpha and IFN－gamma at the effector phase of liver injury mediated by Th1 cells specific to hepatitis B virus surface antigen［J］．J Immunol，2000，165(2):956 － 961．

［5］姜荣龙，卢桥生，骆抗先，等．慢性乙型病毒性感染者外周血T辅助细胞1、2型因子的表达［J］．中华传染病杂志，2000，18(1):26－28．

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［8］Yano S，Ghosh P，Kusaba H，et al．Effect of promoter methylationon the regulation of IFN－gamma gene during in vitro differentiation of human peripheral blood T cells into a Th2 population［J］．J Immunol，2003，171(24):2510 －2516．