表阿霉素免疫纳米微粒靶向抗肝癌作用的研究

杨 峰 黄国祥 袁淑仪 庞 泓 王金林 龚时文

广东省东莞市人民医院，广东东莞 523126

目前原发性肝癌的治疗是以手术为主的综合治疗，但总的手术切除率仅有20%～30%，且术后2年复发率高达50%[1]，因此化疗依然是肝癌治疗重要的辅助手段。为提高传统化疗药物的疗效并减少其毒副作用，靶向给药日益成为治疗肝癌的有效方法，而单克隆抗体和载药纳米微粒则是当前研究的热点[2－4]。笔者在前期研究中选择生物相容性好、可生物降解的天然高分子材料海藻酸钠和阳离子瓜尔胶，利用聚电解质复合法制成具有良好缓释性能的载表阿霉素纳米微粒（E－ADM－NPs）[5]。 本研究将进一步探讨EADM－NPs与抗VEGFR2单克隆抗体的交联，并观察交联物（E－ADM－Ab－NPs）对荷人肝癌裸鼠模型的抗肿瘤作用，以期用于原发性肝癌的靶向治疗。

1 材料与方法

1.1 试剂与动物

海藻酸钠（温州东升试剂厂）；阳离子瓜尔胶（美国E-conomy公司）；盐酸表阿霉素（法玛西亚有限公司）；抗VEGFR2单克隆抗体（美国Biodesign公司）；碳化二亚胺（EDC）（美国 Pierce 公司）；人肝癌 Bel 7402 细胞株（由中科院上海细胞生物研究所提供）；三级BALB/c裸鼠（由中山大学医学动物实验中心提供）。

1.2 E-ADM-Ab-NPs的制备及抗体活性的检测

依据文献方法[5]，利用聚电解质复合法制备E－ADMNPs和未载药 NPs。 称取 10 mg E－ADM－NPs和 2 mg抗VEGFR2单抗溶于pH值7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）中，缓慢加入5 mg EDC，4℃条件下搅拌2 h而后静置过夜。将所得溶液离心后用蒸馏水洗涤3遍，冷冻干燥即可制得EADM－Ab－NPs。 依法制备未载药 Ab－NPs，参考文献[6]利用酶联免疫测定法（ELISA） 对E－ADM－Ab－NPs和未载药Ab－NPs中抗VEGFR2单抗的活性进行检测。

1.3 荷人肝癌裸鼠模型的建立

取对数生长期的人肝癌Bel 7402细胞，用含15%小牛血清的PRMI 1640培养液按1×107/mL的浓度配成细胞悬液供皮下接种。取一定数量4～6周龄的三级BALB/c裸鼠，分别于右侧肩胛部皮下种植0.1 mL细胞悬液，饲养2周后选择生长良好、皮下肿瘤直径0.5～0.7 cm的裸鼠用于肿瘤治疗试验，饲养6周后选择生长良好、皮下肿瘤直径约1.0～1.2 cm的裸鼠用于药物的组织分布试验。

1.4 E-ADM-Ab-NPs在荷瘤裸鼠体内的分布

取体重为（20±2）g/只的荷人肝癌裸鼠12只（雌雄各半），随机分为 E－ADM－Ab－NPs组和 E－ADM－NPs组，两组按含E－ADM 5 mg/kg的剂量分别经尾静脉注射 EADM－Ab－NPs及 E－ADM－NPs。 每只裸鼠给药后 1 h经眼静脉窦取血1.0 mL作样品，然后断颈处死裸鼠，手术分别取出肿瘤、心脏、肝脏、肾脏等组织作样品。利用高效液相色谱法（HPLC）检测荷人肝癌裸鼠组织和血液中E－ADM的浓度。

1.5 E-ADM-Ab-NPs在荷瘤裸鼠体内的抑瘤试验

取体重为（18±2）g/只的荷人肝癌裸鼠48只（雌雄各半），随机分为 8组，每组 6只。A 组：E－ADM－Ab－NPs组；B 组：E－ADM－NPs组；C 组：Ab－NPs组；D 组：E－ADM 原药加抗VEGFR2单抗组；E组：E－ADM原药组；F组：抗VEGFR2单抗组；G组：未载药NPs组；H组：空白对照组。各组制剂分别溶于生理盐水中，按E－ADM每次10 mg/kg、抗VEGFR2单抗每次0.1 mg/kg的剂量经荷瘤裸鼠尾静脉注射，空白对照组注射生理盐水，每隔2天给药1次，共5次。于治疗第11天断颈处死裸鼠，取血清检测谷丙转氨酶、肌酐及白细胞计数。完整剥离瘤体测量长径及短径并称重，用体积=（长径×短径2）/2计算肿瘤体积，观察瘤体积抑制率及瘤重抑制率。瘤体积抑制率=[（对照组平均瘤体积－实验组平均瘤体积）/对照组平均瘤体积]×100%，瘤重抑制率=[（对照组平均瘤重－实验组平均瘤重）/对照组平均瘤重]×100%。

1.6 统计学方法

采用SPSS 11.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析，采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 E-ADM-Ab-NPs的抗体活性

ELISA 法检测表明，E－ADM－Ab－NPs浓度稀释至 1∶1600时，其抗体仍表现出对靶抗原良好的免疫结合活性，其效价与游离抗VEGFR2单抗基本相当。

2.2 E-ADM-Ab-NPs在荷瘤裸鼠体内的分布

E－ADM－Ab－NPs组肿瘤组织中的 E－ADM 浓度为（31.85±4.78）mg/kg，其显著高于 E－ADM－NPs组（P ＜ 0.05），而血液、心脏、肝脏、肾脏等组织中的E－ADM浓度分别为（5.21±0.49）mg/L、（4.40 ±0.33）mg/kg、（3.14 ±0.27）mg/kg、（2.38 ±0.39）mg/kg，均显著低于 E－ADM－NPs组（P ＜ 0.05），见表1。

表1E-ADM-Ab-NPs组及E-ADM-NPs组在荷瘤裸鼠体内的分布（n=6，±s）

表1E-ADM-Ab-NPs组及E-ADM-NPs组在荷瘤裸鼠体内的分布（n=6，±s）

注：与 E－ADM－NPs组比较，*P ＜ 0.05

组别E－ADM 浓度血瘤（mg/kg）血液（mg/L）心脏（mg/kg）肝脏（mg/kg）肾脏（mg/kg）E－ADM－Ab－NPs组E－ADM－NPs组31.85±4.78 8.82±0.71 5.21±0.49*9.73±0.65 4.40±0.33*8.61±0.70 3.14±0.27*7.81±0.68 2.38±0.39*6.65±0.54

2.3 E-ADM-Ab-NPs对荷瘤裸鼠的抗肿瘤作用

治疗11 d后与空白对照组相比，除未载药NPs组外其余各组的肿瘤体积和重量均明显下降，差异具有统计学意义（P ＜ 0.05）。 E－ADM－Ab－NPs组的平均肿瘤体积及瘤体积抑制率为（79.17±18.63）mm3和60.69%，平均肿瘤重量及瘤重抑制率为（0.51±0.16）g和58.54%，显示其抗肿瘤作用强于其他组（P ＜0.05）。 见表2、3。

表2 各组第11天的肿瘤体积和瘤体积抑制率（n=6，±s）

表2 各组第11天的肿瘤体积和瘤体积抑制率（n=6，±s）

注：与 H 组比较，*P ＜ 0.05；与 A 组比较，#P ＜ 0.05；“－”表示无数据

组别 平均肿瘤体积（mm3） 瘤体积抑制率（%）A组B组C组D组E组F组G组H组79.17±18.63*115.31±26.39*#147.36±37.21*#108.95±23.19*#121.79±29.57*#139.45±34.62*#193.52±46.86#201.35±48.17 60.69 42.74 26.82 45.90 39.52 30.75 3.89－

表3 各组第11天的肿瘤重量和瘤重抑制率（n=6，±s）

表3 各组第11天的肿瘤重量和瘤重抑制率（n=6，±s）

注：与 H 组比较，*P ＜ 0.05；与 A 组比较，#P ＜ 0.05；“－”表示无数据

G组H组1.18±0.26#1.23±0.25 4.07－

2.4 毒副作用统计结果

E－ADM－Ab－NPs组的血白细胞计数及血清谷丙转氨酶水平为（6.82±1.09）×109/L 和（40.26±15.27）U/L，与空白对照组相近，差异均无统计学意义（P＞0.05）。E－ADM原药组及E－ADM原药加抗VEGFR2单抗组的血白细胞计数分别为（3.95±0.84）×109/L 和（4.08±0.91）×109/L，明显低于其他组，而血清谷丙转氨酶水平则分别为（72.46±17.02）U/L 和（68.51±15.94）U/L，显著高于其他组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。血肌酐水平在各组中的差异无统计学意义（P ＞ 0.05）。 见表4。

表4 各组血白细胞计数、谷丙转氨酶及肌酐水平比较（n=6，±s）

表4 各组血白细胞计数、谷丙转氨酶及肌酐水平比较（n=6，±s）

注：与H组比较，*P＜0.05；与E组比较，#P＜0.05

组别 白细胞计数（×109/L） 谷丙转氨酶（U/L） 肌酐（μmol/L）A组B组C组D组E组F组G组H组6.82±1.09#6.53±1.02#6.70±1.06#4.08±0.91*3.95±0.84*6.79±1.12#7.04±1.25#6.89±1.18 40.26±15.27#37.42±13.62#39.56±14.78#68.51±15.94*72.46±17.02*39.07±13.98#40.47±15.16#38.53±14.31 14.29±1.75 15.34±1.91 13.74±1.72 14.61±1.63 15.28±1.83 13.72±1.68 14.03±1.79 13.64±1.86

3 讨论

原发性肝癌化疗的总体疗效一直不甚理想，传统的全身静脉化疗对机体有较强的毒副作用，限制了化疗药物在肿瘤局部达到有效浓度，而局部化疗如肝动脉栓塞化疗（TACE）等往往需要创伤性操作才能实现。如何在提高肿瘤组织药物浓度的同时降低正常组织中的药物浓度，是目前肿瘤化疗研究的热点，因此载药纳米微粒靶向治疗具有广阔的前景。

本研究利用聚电解质复合法合成载E－ADM纳米微粒，其载体材料海藻酸钠的分子链上富含羧基和羟基，可通过化学交联与抗VEGFR2单克隆抗体相结合，ELISA法检测表明在E－ADM－Ab－NPs制备过程中抗体活性无明显丧失。VEGFR2主要分布于肿瘤血管内皮表面及原发性肿瘤细胞表面，而在正常组织及良性血管增生性组织中仅呈低水平表达，是介导血管内皮生长因子（VEGF）在肿瘤新生血管形成中发挥功能的主要受体[7－9]。原发性肝癌组织的VEGFR2阳性表达率达60%～70%[10]，而抗VEGFR2单抗是针对VEGFR2的特异性抗体，能将化疗药物携带至肿瘤组织中发挥免疫靶向治疗作用[11－13]。荷人肝癌裸鼠模型体内的分布试验表明，E－ADM－Ab－NPs可选择性地集中于肿瘤组织，而在血液、心脏、肝脏、肾脏等正常组织中的分布较少。E－ADM－Ab－NPs具有的良好缓释性能可使肝癌组织较长时间处于有效的药物浓度中，同时抗VEGFR2单抗可竞争性抑制VEGF与VEGFR2结合，从而抑制肿瘤血管的生成[14－15]。荷人肝癌裸鼠模型的体内治疗发现，E－ADM－Ab－NPs组的瘤体积抑制率和瘤重抑制率明显高于E－ADM原药组，有助于临床上减少化疗药物的单次用量，并避免长时间持续静脉用药所带来的不便。包含E－ADM原药各组的荷瘤裸鼠血白细胞计数明显低于空白对照组，血清谷丙转氨酶水平明显高于空白对照组，而E－ADM－Ab－NPs组的血白细胞计数和血清谷丙转氨酶水平则与空白对照组相近，表明E－ADM－Ab－NPs可减少E－ADM原药的骨髓抑制和肝功能损害等毒副作用。

综上所述，本研究合成的E－ADM－Ab－NPs由于纳米微粒的缓释性能及抗VEGFR2单抗的导向作用，可明显提高其对荷人肝癌裸鼠模型的抗肿瘤效应，并降低E－ADM原药的全身毒副作用，是一种安全有效的新型肝癌靶向治疗制剂，具备良好的临床应用前景。

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