表皮生长因子受体2和血管内皮生长因子在胃癌中的表达及其临床意义

吴 晓，陈 蕾，庄轶轩，陈炯玉，洪超群，奚少彦，张 灏

胃癌是最常见的消化系统肿瘤，居恶性肿瘤死亡率的第2位。其5年总生存率仅为15%～35%。和其他恶性肿瘤一样，胃癌患者引起死亡的主要原因是转移及侵袭。引起胃癌发生、发展的因素很多，生长因子及其受体信号途径尤受关注。人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)为人类表皮生长因子受体家族成员之一。HER2蛋白具有酪氨酸激酶活性，在与其他受体结合后，通过多条信号转导通路调节细胞的生长、分化和增殖。已有报道显示HER2蛋白的过表达和(或)基因扩增与胃癌复发、转移和不良预后密切相关[1]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是肿瘤的促血管生成因子之一，其过度表达与肿瘤生长、侵袭及转移关系密切[2]。Saito等[3]研究甚至提示VEGF是胃癌的一个独立预后因素。为了进一步探讨这两者的表达与胃癌的发生和发展的关系，利用免疫组化(immunohistochemistry，IHC)的方法与荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)的方法检测了103例胃癌患者术后标本中HER2的表达与扩增间的关系，利用IHC的方法检测VEGF在胃癌中的表达状态，并分析两者的表达与胃癌临床病理因素之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织 收集中山大学附属肿瘤医院2011年胃癌根治性手术标本103例，术前均未进行放化疗。按国际抗癌联盟(Union for International Cancer Control，UICC)肿瘤临床分期(tumor node metastasis，TNM)，Ⅰ期15例，Ⅱ期16例，Ⅲ期59例，Ⅳ期13例，其中管状腺癌91例、印戒细胞癌12例;女性39例、男性64例，平均年龄55.6(23～79)岁;位于贲门部的肿瘤7例，其余临床病理指标见表1。

1.1.2 主要试剂 鼠抗人HER2单克隆抗体与辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记通用性EnVision试剂盒购自丹麦DAKO公司，兔抗人VEGF单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司;HER2探针购于北京金菩嘉公司。

1.2 方法

1.2.1 IHC染色 标本均经10%中性甲醛缓冲固定液，石蜡包埋，4 μm厚切片，pH 8.0乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗原热修复，EnVision二步法染色。HER2、VEGF抗体为1∶200，按说明书进行染色，二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)显色，苏木精对比染色，透明封固，阳性对照及阴性对照由试剂公司提供。

1.2.2 IHC结果判定 HER2的结果判断，阳性表达定位于细胞膜，为棕黄色颗粒。细胞膜均无染色或≤10%肿瘤细胞膜染色者结果为“0”(阴性);肿瘤细胞＞10%，细胞膜不完整，弱染色者结果为“+”(阴性);肿瘤细胞＞10%，细胞膜基底膜和侧膜轻度至中度完整，染色者结果为“++”(不确定);肿瘤细胞＞10%，细胞膜基底膜和侧膜完整，强染色者结果为“+++”(阳性)。

VEGF的结果判断，阳性定位于肿瘤细胞胞质与胞膜染色，为棕黄色颗粒，采用3个参数(即染色强度、阳性细胞数和两者记分的乘积)的半定量的计数方法。着色强度记分标准:无着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。随机选取10个高倍视野(×400)计数肿瘤细胞的阳性细胞百分率，记分标准:无染色为0分，1%～10%为1分，11%～25%为2分，26%～50%为3分，＞50%为4分。染色强度记分与阳性细胞数记分之积为最后得分，1～3分为阴性，＞3分为阳性染色。

1.2.3 FISH方法 具体步骤:厚度3～5 μm的切片经二甲苯脱蜡、复水、沸水浴30 min;200 μg/ml蛋白酶K 37℃作用20～40 min;10%中性福尔马林固定10 min，梯度乙醇脱水;加入10 μl探针混合液，83℃变性5 min，42℃过夜杂交。经2×SSC(氯化钠300 mmol/L、柠模酸钠30 mmol/L)46℃ 5 min，0.1%乙基苯基聚乙二醇(nonyl phenoxy polyethoxy ethanol，NP)-40/2 ×SSC 46℃ 5 min，70%乙醇3 min洗片，干燥后，室温下将15 μl 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)复染剂滴加于玻片杂交区域，立即盖上盖玻片，15 min后在荧光显微镜下观察。

1.2.4 FISH结果判断 由专门受过培训的病理医师在荧光显微镜下判断，计数30个肿瘤细胞的红、绿信号数，当Ratio＜1.8为阴性结果，提示该样本无HER2基因扩增;Ratio在1.8～2.2之间时，增加细胞计数至100个肿瘤细胞或重做FISH实验来判断最终结果;Ratio＞2.2为阳性结果，提示HER2基因扩增;当红色信号呈簇状扩增时，无论绿色信号为多少，都记为阳性结果。

1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件进行分析。率比较采用χ2检验，两组间比较采用t检验，小样本资料选用Fisher精确检验法，指标间的相关性采用Spearman等级相关分析法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HER2在胃癌中的表达与临床病理参数的关系 IHC显示HER2在胃癌的中阳性表达，位细胞膜上(图1)。用IHC的方法，HER2在胃癌中的蛋白表达，103例标本中，阳性表达(+++)为10例(9.8%)、不确定阳性(++)为4例(3.8%)、阴性(0和+)为89例(86.4%)，且所有阳性和不确定阳性病例的病理分型均为管状腺癌。

图1 胃癌组织中HER2蛋白表达(EnVision法，×400)

FISH显示当Ratio＞2.2或当红色信号呈簇状扩增时，提示HER2扩增，在胃癌中阳性表达(图2)。将IHC显示为阳性及不确定阳性的病例共14例重新通过FISH校正，结果显示10例阳性病例中有9例扩增，4例不确定阳性病例中有2例扩增。在阳性病例中IHC与FISH的符合率为90%，有良好的相关性(P＜0.01)。HER2的扩增(过表达)明显与胃癌的病理分级、淋巴结转移与否及Lauren分型相关(P ＜0.05，表1)。

图2 胃癌组织中HER2蛋白表达(FISH法)

2.2 VEGF在胃癌中的表达与临床病理参数的关系 胃癌组织中VEGF主要阳性表达于细胞质和细胞膜(图3)。大部分胃癌细胞存在不同程度的染色，评分在1～12分之间，其中46例在1～3分之间，25例在4～12分之间。VEGF在胃癌的表达阳性率约为24%(25/103)。VEGF的阳性表达与肿瘤的浸润深度、病理分级、Lauren分型相关(P＜0.05，表1)。虽然在统计学上未发现VEGF与TNM分期、淋巴结转移与否及肿瘤的大小存在显著相关性，但从表1中可以看出随着肿瘤的进展，VEGF的表达率是上升的。

图3 胃癌组织中VEGF蛋白表达(EnVision法×400)

表1 103例中HER2及VEGF与胃癌临床病理参数的关系

2.3 HER2与VEGF在胃癌中的表达关系 本组103例胃癌组织中，HER2与VEGF同时阳性表达4例，同时阴性表达71例，统计学上未发现两者有相关性(P ＞0.05，表 2)。

表2 103例中HER-2与VEGF在胃癌中的表达关系

3 讨论

HER2基因定位于人染色体17q21，编码由1 225个氨基酸组成的跨膜糖蛋白(p185)，相对分子质量为185×103，包含N末端胞外黏合区、跨膜区和具有酪氨酸激酶活性的C末端胞内区3个部分[4]。HER2蛋白具有酪氨酸激酶活性，可通过多条信号转导通路调节细胞生长、增殖与分化。多项研究表明HER2过表达与肿瘤的预后不良相关[5-6]，同时HER2扩增(过表达)是应用分子靶向药物曲妥珠单抗治疗的指征。在本研究中，胃癌HER2的扩增率约为11%(11/103)，且与肿瘤的分化程度高度相关，中分化癌HER2的扩增率明显高于低分化癌(P＜0.05)，在肠型胃癌中的扩增率明显高于弥漫型，印戒细胞癌中未见HER2的扩增(过表达);同时，HER2的扩增率在淋巴结阳性组明显高于淋巴结阴性组。这提示HER2与分化较好的胃管状腺癌的发生、发展密切相关，与Yu等[7]的研究一致。在胃癌中特别是管状腺癌中，检测HER2的状态有明确的临床意义。本研究同时表明，用FISH检测HER2基因扩增和应用IHC检测HER2蛋白过表达结果之间有极好的相关性，与刘学政等[8]的报道一致。HER2基因的扩增是HER2蛋白过表达的主要机制[9]，由于IHC操作简便、费用低廉，适于初筛。FISH的敏感性和特异性较高，有标准化阳性判断标准，可进行定量分析。对于IHC HER2检测为不确定阳性(++)的患者建议做FISH检测，以确定有无HER2基因的扩增来指导临床应用靶向药物。

VEGF基因定位于染色体6p21.3，是一个相对分子质量为(34～45)×103的高度糖基化碱性蛋白，是由相对分子质量为(17～22)×103的同源双聚体所构成。VEGF在体内能特异性促进内皮细胞分裂，增加毛细血管的通透性，诱导内皮细胞迁移，诱导血管的生成。在肿瘤中，其表达与肿瘤的生长、侵袭及转移关系密切。文献报道，胃癌VEGF阳性患者较阴性患者的预后更差[10-11]。VEGF阳性是胃肠道肿瘤应用分子靶向药贝伐单抗的指征。本研究IHC显示，大部分胃癌细胞均存在不同程度的染色，评分在1～12分之间，阳性表达主要在分化较好的管状腺癌，浸润较深的肿瘤表达率明显高于浸润较浅的肿瘤，这表明VEGF参与了分化较好的胃癌的发生、发展。

在本组研究中，未发现HER2的扩增与VEGF的表达存在相关性。Yamashita-Kashima等[12]的研究也发现，在胃癌治疗中VEGF的阳性表达是应用靶向药贝伐单抗的分子指征，同时贝伐单抗的敏感性并没有与HER2的状态相关。这提示了HER2与VEGF虽然都参与了胃癌的发生、发展，同样是靶向治疗的靶点，但它们作用于胃癌的分子通路可能是不一致的。综上所述，联合检测HER2及VEGF在胃癌(特别是肠型胃癌)中的状态有助于了解胃癌的发生、发展及靶向药物曲妥珠单抗和贝伐单抗的选择。对进一步深入研究胃癌的发生、转移的分子机制，探索更多新的药物靶点，对胃癌进行个体化治疗具有重要意义[13]。

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